化学アプローチと質量分析によってニトロペプチドを濃縮し同定する方法についての重要な質問に答えることができるこのメッセージ。この技術は、質量分析法によってニトロペプチドを検出するための高められた感受性を有し、それはインビトロ生化学系および内因性生物学的組織の両方に適用することができる。ニトロアンジオテンシンII脱塩の場合、1ミリリットルのピレットを使用して、メタノール500マイクロリットルと500マイクロリットルの水をカラムの上部に添加して、逆相固相抽出またはSPEカラムを予調します。
すべての水がカラムを通り抜けたら、410マイクロリットルのニトロアンジオテンシンII溶液をカラムに積み込みます。5%メタノールと水の500マイクロリットルと80%メタノールと水の300マイクロリットルでカラムを洗浄し、ニトロペプチドを溶出させます。その後、室温でデフォルト設定で真空速度で溶出物を乾燥させます。
一次アミンアルキル化の場合、粉末ニトロアンジオテンシンIIを100ミリモルトリエチランモニウム重炭酸塩溶液100マイクロリットルで再構成し、4%ホルムアルデヒドの400マイクロリットルをヒュームフードに加えて、短い混合を行う。次に、0.6モルのシアノ水素化ナトリウムを4マイクロリットル加え、室温で1時間毎分400回転で振る。インキュベーションの終了時に、16マイクロリットルの1%アンモニア溶液を室温で5分間焼き付け、続いて8マイクロリットルのギ酸で酸性化します。
次に、ちょうど示したように、新しい逆相SPE列で溶液を脱塩します。ニトロチロシンからアミノチロシンへの還元のために、ジメチル標識ニトロアンジオテンシンIIをPBSの500マイクロリットルで再構成し、10マイクロリットルのモルルナトリウムジチオン酸を室温で1時間インキュベートする。還元反応後、黄色の溶液が明らかになります。
デモに示すように、新しい逆相SPEカラムで還元サンプルを脱塩します。ビオチン化および濃縮のために、ジメチル標識アミノアンジオテンシンIIを500マイクロリットルのPBSで再構成し、続いて40ナノモルNHS-Sビオチンをジメチルスルホキシドに溶解した5マイクロリットルを室温で2時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、5%ヒドロキシラミンの1マイクロリットルで反応をクエンチし、3つの別々の遠心分離によって平衡化するためにストレプトアビジンアガロースビーズの100マイクロリットルに新鮮なPBSの500マイクロリットルを追加します。
最後の遠心分離の後、室温でロータリーシェーカーに1時間インキュベーションを行い、反応系に100マイクロリットルのビーズを加えます。インキュベーションの最後に、1回の洗浄ごとに500マイクロリットルの新鮮なPBSでシステムを4回洗浄し、続いて摂氏50度で45分間のインキュベーションに10ミリモルジチオトレイトールを400マイクロリットル添加します。インキュベーションの終わりに、カラムをスピンダウンし、20マイクロリットルの0.5モルヨウアセトアセトアミドを含む新しいチューブに上清を移し、暗闇の中で20分間インキュベーションします。
次に、新しい逆相SPEカラムで溶液を脱塩し、乾燥ペプチドを0.1%のギク酸の20マイクロリットルで分解します。検出のために、タンデム質量分析計を用いて液体クロマトグラファーに製品をロードします。高分解能質量分析計と直接インターフェースするナノ高圧液体クロマトグラフィーシステムにより、変性アンジオテンシンIIペプチドを毎分0.3マイクロリットルの流量で60分の勾配輝度で分離します。
データ依存型取得モードでは、質量分析計に単一のフルスキャン質量スペクトルを設定し、続いて28%正規化された衝突エネルギーで20のデータ依存タンデム質量分析計スキャンを行います。次に質量スペクトルデータを開き、各工程で生成物のピークを特定し、化学反応が正常に行われたことを確認します。ここで、アンジオテンシンIIの代表的な質量スペクトルは、実証された各化学修飾の前後に観察できる。
化合物の分子量はモノ同位体ピークの質量電荷比値で示され、アンジオテンシンIIに対する化学修飾がそのステップに対して正常に達成されたことを示す。ここで、タンデム質量分析を用いた液体クロマトグラフィーによって検出され特徴付けられる最終生成物が示されている。ジメチル標識によるニトロペプチドの定量的分析は、各群におけるモノ同位体ピークの強度の比較を通じて、軽くて重い量の相対的量を計算することを可能にし、異なる群からの濃縮されたニトロペプチドの定量を可能にする。
手順に従って、潜在的なニトロペプチドを識別するために、pFINDのSEQUESTの最大カウントなどのプログラム検索エンジンを使用することができます。開発後、この技術は、特定のニトレーション部位の生物学的機能の開始への道を開いた。
