화학적 접근법과 질량 분석법에 의해 니트로펩티드를 풍부하게 하고 식별하는 방법에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 되는 이 메시지. 이 기술은 질량 분광법에 의해 니트로 펩티드를 검출하기위한 향상된 감도를 가지고 있으며 체외 생화학 시스템 및 내인성 생물학적 조직 모두에 적용 될 수 있습니다. 니트로-안지오텐신 II 탈염의 경우, 1밀리리터 파이펫을 사용하여 역상 고체 상 추출 또는 SPE 컬럼을 조건으로 하고 500마이크로리터의 메탄올과 500마이크로리터의 물을 컬럼 의 상단에 넣습니다.
모든 물이 컬럼을 통과하면 니트로-안지오텐신 II 용액 410마이크로리터를 기둥에 적재합니다. 5%메탄올과 물 500마이크로리터, 80%의 메탄올과 물의 300마이크로리터로 컬럼을 세척하여 니트로펩티드를 엘로펩티드로 처리합니다. 그런 다음 실온에서 기본 설정에서 속도 진공으로 용액을 건조시킵니다.
1차 아민 알킬링을 위해 100밀리머 트리에틸라모늄 중탄산염 용액의 100마이크로리터에 분말 니트로-앙지오텐신 II를 재구성하고, 짧은 혼합이 있는 연기 후드의 용액에 400마이크로리터를 첨가한다. 다음으로, 실온에서 1시간 동안 분당 400회전에서 흔들림을 가하는 용액에 0.6 개의 어금니 나트륨 시아노보로하이드라이드의 4마이크로리터를 추가합니다. 인큐베이션이 끝나면 실온에서 5분 동안 16마이크로리터의 16마이크로리터를 담금질한 다음 포믹산 8마이크로리터로 산성화를 한다.
그런 다음 방금 설명한 대로 새로운 역상 SPE 컬럼에서 솔루션을 탈염합니다. 아미노티로신 감소에 니트로티로신을 위해, PBS의 500 마이크로 리터에서 디메틸 라벨 니트로 앙지오텐신 II를 재구성하고 실온에서 1 시간 동안 1 0 개의 어금니 나트륨 디티오나테의 마이크로 리터를 추가하십시오. 감소 반응 후, 노란색 용액이 명확해질 것입니다.
입증된 바와 같이 새로운 역상 SPE 컬럼에서 감소된 샘플을 탈염합니다. 바이오타이니션 및 농축을 위해 PBS 의 500 마이크로리터에서 디메틸 라벨이 부착된 아미노안지오텐신 II를 재구성한 다음, 실온에서 2시간 동안 디메틸 설프옥사이드에 용해된 40나노몰러 NHS-S-S 비오틴 5마이크로리터를 첨가한다. 인큐베이션의 끝에서, 5%의 하이드록실라민의 1개의 마이크로리터로 반응을 담금질하고 3개의 분리된 원심분리에 의하여 평형을 위한 스트렙타비딘 아가로즈 구슬의 100마이크로리터에 신선한 PBS의 500 마이크로리터를 추가합니다.
마지막 원심분리 후, 실온에서 로타리 셰이커에 1시간 동안 반응 시스템에 100마이크로리터의 구슬을 넣습니다. 인큐베이션이 끝나면 세척당 500마이크로리터의 신선한 PBS로 시스템을 4회 세척한 다음 10밀리머 디티오트레이톨400마이크로리터를 섭씨 50도에서 45분간 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 기둥을 회전시키고 상체를 0.5 개의 어금니 오도아세타미드20 마이크로리터가 들어있는 새로운 튜브로 옮겨 어둠 속에서 20 분 동안 배양하십시오.
그런 다음 새로운 역상 SPE 컬럼에서 용액을 탈염시키고 0.1%의 마이크로리터에서 건조 펩티드를 해결한다. 검출을 위해 탠덤 질량 분광계를 사용하여 액체 크로마토그래퍼에 제품을 적재합니다. 고해상도 질량 분광계와 직접 인터페이스되는 나노 고압 액체 크로마토그래피 시스템과 분당 0.3 마이크로리터의 유속도로 60분 그라데이션 용출으로 수정된 안지오텐신 II 펩티드를 분리한다.
데이터 종속 획득 모드에서는 질량 분광계에 단일 전체 스캔 질량 스펙트럼을 설정하고 20개의 데이터 의존성 탠덤 질량 분광계 스캔을 28% 정규화된 충돌 에너지로 설정합니다. 그런 다음 질량 스펙트럼 데이터를 열고 화학 반응이 성공적으로 수행되었는지 확인하기 위해 각 단계에서 제품의 피크를 식별합니다. 여기서, 입증된 바와 같이 각 화학적 수정 전후안지오텐신 II의 대표적인 질량 스펙트럼이 관찰될 수 있다.
화합물의 분자량은 단동원위원 봉우리의 질량 대 전하 비율 값에 의해 표시되며, 안지오텐신 II에 대한 화학적 변형이 성공적으로 달성되었음을 나타낸다. 여기서, 최종 생성물은 탠덤 질량 분석법을 가진 액체 크로마토그래피를 검출하고 특징으로 하는 것으로 나타났다. 디메틸 라벨링에 의한 니트로펩티드의 정량적 분석은 각 군에서 단동원 피크의 강도를 비교하여 상대적으로 가볍고 무거운 양의 빛을 계산할 수 있게 해주며, 다른 군으로부터 농축된 니트로펩티드의 정량화를 허용한다.
절차에 따라 PFIND의 SEQUEST 최대 수와 같은 프로그램 검색 엔진을 사용하여 잠재적인 니트로펩티드를 식별할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 특정 nitration 사이트의 생물학적 기능의 시작을위한 길을 열었다.
