Kimyasal bir yaklaşım ve kütle spektrometresi ile azotların nasıl zenginleştirilip tanımlanabileceği ile ilgili anahtar soruların cevaplanabildiği bu mesaj. Bu teknik, kütle spektrometresi ile nitropeptidlerin saptanması nda gelişmiş bir duyarlılığa sahiptir ve hem in vitro biyokimyasal sistemlere hem de endojen biyolojik dokulara uygulanabilir. Nitro-anjiyotensin II tuzsuzlaştırma için, bir mililitrelik pipet kullanarak bir ters faz katı faz ekstraksiyonunu veya SPE kolonunu 500 mikrolitre metanol ve 500 mikrolitre suyun kolon üst lerine eklenmesiyle ön koşula getirin.
Tüm su kolon boyunca aktığında, kolon üzerine nitro-anjiyotensin II çözeltisi 410 mikrolitre yükleyin. Nitropeptid'i temizlemek için kolonu %5 metanol ve su 500 mikrolitre ve %80 metanol ve su 300 mikrolitre ile yıkayın. Daha sonra oda sıcaklığında varsayılan ayarda hız vakum tarafından eluate kuru.
Primer amin alkiliyasyonu için, 100 milimolar Triethylamonnium bikarbonat çözeltisinin 100 mikrolitresinde toz nitro-anjiyotensin II'yi yeniden oluşturmak ve kısa karıştırma ile bir duman kaputunda çözeltiye 400 mikrolitre 400 mikrolitre formaldehit ekleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında bir saat boyunca dakikada 400 rotasyonsal sallayarak çözeltiye 0,6 molar sodyum cyanoborohyride dört mikrolitre ekleyin. Kuluçka sonunda, 16 mikrolitre 1%amonya çözeltisi ile etiketleme reaksiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca bastırın ve ardından sekiz mikrolitre formik asit ile asitleşmeyi takip edin.
Daha sonra çözeltiyi yeni bir ters faz SPE sütunundaki tuzdan arındırın. Aminotirozin indüksiyonuna kadar nitrotirozin için, 500 mikrolitre PBS'de dimetil etiketli nitro-anjiyotensin II'yi yeniden oluşturun ve oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için bir molar sodyum ditionat 10 mikrolitre ekleyin. Azaltma reaksiyonundan sonra sarı çözelti netleşir.
Gösterildiği gibi yeni bir ters faz SPE sütunundaki azaltılmış numuneyi tuzdan arındırın. Biyotinylasyon ve zenginleştirme için, pbs 500 mikrolitre dimetil etiketli aminoanjiyotensin II yeniden ve ardından 40 nanomolar NHS-S-S biyotin beş mikrolitre eklenmesi oda sıcaklığında iki saat kuluçka için dimetil sülfoksit çözünmüş. Kuluçka sonunda reaksiyonu %5 hidroksilin mikrolitresiyle söndürün ve streptavidin Agarose boncuklarının 100 mikrolitresine 500 mikrolitre taze PBS ekleyin.
Son santrifüjden sonra, oda sıcaklığında bir Döner Çalkalayıcı üzerinde bir saatlik kuluçka için reaksiyon sistemine 100 mikrolitre boncuk ekleyin. Kuluçka sonunda, yıkama başına taze PBS 500 mikrolitre ile dört kez sistemi yıkayın ve ardından 50 santigrat derecede 45 dakikalık bir kuluçka için 10 milimolar dithiothreitol 400 mikrolitre ilave edin. Kuluçka sonunda, sütun aşağı spin ve karanlıkta 20 dakikalık kuluçka için 0,5 molar iodoacetamide 20 mikrolitre içeren yeni bir tüp içine supernatant aktarın.
Daha sonra gösterildiği gibi yeni bir ters faz SPE sütunda çözelti yitin ve% 0.1 formik asit 20 mikrolitre kuru peptid çözmek. Algılama için ürünü tandem kütle spektrometresi olan sıvı bir kromatografa yükleyin. Modifiye anjiyotensin II peptidleri, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile doğrudan arayüz lenen nano-yüksek basınçlı sıvı kromatografi sistemi ile dakikada 0,3 mikrolitre likit bir akış hızıyla 60 dakikalık degrade eluzyon ile ayırın.
Veriye bağımlı toplama modunda, kütle spektrometresinde tek bir tam tarama kütle spektrumu ayarlayın ve ardından %28 normalleştirilmiş çarpışma enerjisinde 20 veriye bağımlı tandem kütle spektrometresi tarar. Daha sonra kütle spektrum verilerini açın ve kimyasal reaksiyonun başarıyla gerçekleştirildiğini doğrulamak için her adımda ürünün tepe noktalarını belirleyin. Burada, anjiyotensin II'nin temsili kütle spektrumları her kimyasal modifikasyondan önce ve sonra gözlemlenebilir.
Bileşiğin moleküler ağırlığı mono izotop tepenin kütle-yük oranı değerleri ile gösterilir, anjiyotensin II kimyasal modifikasyon u başarılı bir şekilde bu adım için elde edildiğini gösteren. Burada tandem kütle spektrometresi ile sıvı kromatografisi ile saptanan ve karakterize edilen son ürün gösterilmiştir. Dimetil etiketleme ile nitropeptidlerin nicel analizi, her gruptaki mono izotop tepeyoğunluğunun karşılaştırılması yoluyla göreceli ışık ve ağır miktarlarının hesaplanmasına olanak sağlayarak, farklı gruplardan zenginleştirilmiş nitropeptidlerin ölçülmesine olanak tanır.
Prosedürü takiben, olası nitropeptidleri belirlemek için pFIND'In SEQUEST max sayısı gibi bir program arama motoru kullanabilirsiniz. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra belirli nitrasyon bölgelerinin biyolojik fonksiyonlarının başlamasının önünü açmıştır.
