この研究は、ラベルフリータンパク質を単一分子レベルでリアルタイムに洞察を得ることを目的としており、特に現在の技術では研究が困難なタンパク質や疾患に関連するタンパク質に焦点を当てています。プラズモニックナノピンセットは、最近、低分子に結合した際のコンフォメーションダイナミクスのモニタリング、分解速度のチェック、自由エネルギーのランドスケープの解明など、すべて単一分子レベルでの能力を実証しています。現在、確立されたタンパク質特性評価技術では、ラベルフリーの単一分子タンパク質コンフォメーションダイナミクスを調査できるものはありません。
プラズモニックナノピンセットは、この分野のニッチを埋める可能性を秘めていると考えられています。このユニークな利点は、タンパク質のコンフォメーション変化とその生物学的機能との関連、および疾患発症への影響を調査するのに役立ちます。今後の研究では、天然変性タンパク質や膜タンパク質に焦点を当てる予定ですが、これらの多くがアルツハイマー病、パーキンソン病、さまざまながんなどのいくつかの疾患に関与していると考えられています。
まず、PEG-チオールでコーティングされたサンプルをストレートピンセットを使用して3Dプリントされたフローセルに入れ、金の層が上を向くようにします。透明なPETプラスチック両面テープカバーの片面をはがします。テープをサンプルとフローセルに慎重に置き、フローセルのナノ構造とインテーク/アウトテイク穴が覆われないようにします。
丸みを帯びたピンセットを使用して、テープの端をそっと押して、フローセルとサンプルへのテープの接着を固定します。テープの反対側をはがし、サンプルの上にガラスカバースリップをそっと置きます。丸みを帯びたピンセットを使用して、カバースリップの端を押し、カバースリップの接着を固定します。
このプロセスにより、フローセル内に高さ50マイクロメートル、体積3.5マイクロリットルの液体チャネルが形成されます。小さなピペットチップを使用して、複製シリコーンの溶液Aと溶液Bの等量を顕微鏡スライドに1対1の比率で混合するか、メーカーが指定します。カバースリップとフローセルの間の隙間を混合複写シリコーンで埋め、カバースリップの下にそっと押し込みます。
フローセルを逆さまにして持ち、穴の内壁の周りに複製シリコーンを慎重に塗布します。サンプルの溶融シリカの下側の目に見える端にシリコーンをそっと動かし、複製するシリコーンが完全に固まるまで、金の層を上に向けてサンプルを乾燥させます。すべてのコンポーネントが正しく接続されていることを確認したら、マイクロ流体システムのUIをコンピューターにロードします。
MUXディストリビューターとワイヤーの横にある再生アイコンをクリックすると、12×1つのロータリーバルブと3×2ウェイバルブをそれぞれ制御して、対応するインターフェースを開きます。3ウェイバイツーウェイバルブをバイパスするには、ワイヤのポート1をオンにします。フローセルをプラズモニックナノピンセットに取り付けるには、インレットチューブとアウトレットチューブをフローセルの適切な部分に取り付けます。
フローセルをきれいな組織の上に置き、金の層を上に向けて置きます。バッファーを毎分約0.3ミリリットルの高流量でフローセルに注入します。流体がフローセル内のサンプルを横切って移動し、外部または下部に流体が見えないことを確認します。
100X対物レンズに1〜2滴の浸漬油を塗ります。金層を下に向けて、フローセルをプラズモニックナノピンセットステージに配置します。金属製のクリップでフローセルをマグネットに固定し、ステージをロックして所定の位置に固定します。
白色光源をオンにします。カメラソフトウェアを開き、ナノ構造が見えるまで露光時間とゲインを調整します。比較的高出力でレーザーをオンにし、レーザースポットが見えるまでZ軸を手動で調整します。
圧電コントローラーの電源を入れ、通信ポートと最大容量の適切な設定を選択しますtage。X、Y、およびZ軸の値を最大電圧の半分に設定して、すべての方向でステージの位置合わせを改善します。メインステージのX軸、Y軸、Z軸コントロールノブを使用して、レーザースポットをダブルナノホールまたはDNH構造の1つに位置合わせします。
アバランシェフォトダイオードまたはAPDがオンになっていることを確認します。プラズモニックナノピンセットの筐体を静かに閉じます。APD記録に関連するソフトウェア(自作のLabVIEW UIなど)を開きます。ファイル名を編集し、カットオフ周波数を 1 キロヘルツに設定します。
次に、ファイルを保存する目的のファイルパスを指定します。白色光源の電源をオフにしてから、レーザーをオンに戻します。レーザー出力を適切なレベルに設定した後、圧電制御を使用して、APD信号ができるだけ高くなるまでX、Y、およびZ軸を調整します。
APDの飽和を回避し、トレースの標準偏差を最小限に抑えます。次に、ナノ構造の寿命を維持するために、レーザーをオフにします。シリンジポンプ制御ユニットとディストリビューターUIを実行してバルブを設定し、必要な量のタンパク質を引き出します。
マイクロ流体UIを使用して、離脱速度と同様の流速でタンパク質溶液を注入します。タンパク質溶液がフローセルに到達するまで、この速度で注入を続けます。その後、流量をトラップに適した値に設定し、トレースが安定するのを待ちます。
シリンジポンプの容量と時間が期待値と一致していることを確認します。APD信号データを記録するには、圧電コントローラーUIを使用して、必要に応じてX、Y、Z軸を調整します。透過率と標準偏差に大きな変化が見られた場合は、将来のデータソートのためにこれが発生する時間を書き留めます。実験の一環としてタンパク質を放出する必要がある場合は、レーザーを約5秒間オフにしてから、再度オンにします。
トレースは、伝送に大きな変化があり、標準偏差が大幅に低く、ベースライン状態に戻ることを示します。実験が完了したら、レーザーをオフにしてください。フローセルを3軸ステージから取り外し、マイクロ流体システムのチューブを外します。
フローセルをきれいな組織の上に置き、金の層を上に向けて置きます。メスを使って、ガラスカバースリップの下の接着剤を慎重に切り取ってから、そっと持ち上げて廃棄します。金の層が上を向いたままフローセルを斜めに保持し、丸みを帯びたピンセットを使用してフローセルの下側から接着剤を慎重に取り除き、サンプルを解放します。
ストレートピンセットを使用してサンプルを拾い上げ、イソプロパノールで十分にすすいでください。エアガンを使用してサンプルを乾燥させます。アポフェリチン分子へのin-situ鉄負荷で行われた代表的な実験は、タンパク質の立体構造ダイナミクスを調査するためのツールとしてのプラズモンナノピンセットの使用を示しています。
アポフェリチンの透過トレースは、PBS溶液にトラップされても安定しており、大きなコンフォメーション変化がないことを示しています。鉄溶液に曝露すると、トレースの標準偏差の変動が増加し、鉄負荷に関連する動的な構造変化を示しています。鉄を20分間曝露すると、透過トレースが安定し、アポフェリチンがホロフォームに移行したことが示されました。
確率密度関数プロットは、鉄の負荷による電圧分布のシフトを示し、アポフェリチンからホロフェリチンへのコンフォメーション遷移をさらに支持しました。
