HIVは、細胞および解剖学的貯水池の持続性のために不治である。この方法は、肺から単離された免疫細胞のHIV貯留層評価を可能にする。この技術は、HIVの細胞貯留部としてさらなる表現性またはウイルス学的評価のために、BAL液から肺粘膜T細胞および肺胞マクロファージを単離することを可能にする。
肺胞マクロファージとCD4陽性T細胞の生物学とHIVリザーバーへの貢献を理解することは、HIV治療が直面している課題に関する重要な洞察につながる可能性があります。BALからの主要なマクロファージの分離は、喘息および結核などの炎症性または感染性肺疾患を含む様々な他の研究分野に適用することができる。標準的なプロトコルに従って人間の患者からBAL液を得た後、バイオセーフティキャビネット内の50ミリリットルのチューブにサンプルを移す前に、元のコレクションチューブ内の流体を渦液。
流体が非常に濁ったり、糸状組織によって汚染されている場合は、70マイクロメートルのナイロンメッシュフィルターを通してサンプルを新しい50ミリリットルチューブにフィルターします。遠心分離後、上清を新しい50ミリリットルチューブに移し、ピペットチップを使用してBAL細胞全体を含むペレットをそっと分解します。ペレットをRPMI 1640培地の1ミリリットルに再懸濁し、10個の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管のそれぞれの予約上清の1ミリリットルを加える。
残りの上清の10ミリリットルのアリコートを15ミリリットルの円錐管に加え、すべての上清サンプルをマイナス80°Cの貯蔵に入れます。元のサンプルの25ミリリットルごとに10ミリリットルの培地でペレット細胞懸濁液を希釈し、遠心分離によってBAL細胞を収集します。その後、10%の胎児ウシ血清(FBS)を添加した培地の1ミリリットルでペレットを再懸濁し、カウントする。
BALおよび末梢血単核細胞全体の選別については、5つの細胞に5倍の5倍の10を5倍の5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブをサブセットごとに加え、染色されていない補償制御と生存性染色補償コントロールを行い、残りのサブセットサンプルを1つの5ミリリットルチューブに1本ずつ加えます。遠心分離によって細胞を収集し、それらが使用されるまで氷の上のチューブあたりPBSの100マイクロリットルでコントロールペレットを再中断します。細胞のペレットを20マイクロリットルのFc受容体遮断バッファーの20マイクロリットルで摂氏4度で1時間ずつ再懸濁し、非特異的結合を遮断する。
ブロッキングインキュベーションの最後に、摂氏4度でさらに1時間のインキュベーションを目的とする適切な抗体カクテルを追加します。一次抗体インキュベーションの終わりに、遠心分離のために各チューブにPBSを1ミリリットル加え、選別するまで氷上の選別バッファーの250マイクロリットルでペレットを再中断します。補償制御を調製するために、PBSの1ミリリットル当たりの抗マウス免疫グロブリンκ補償ビーズと陰性対照補償ビーズをマイクロ遠心チューブにそれぞれ3滴ずつ加え、各サンプルに100マイクロリットルのビーズ溶液を移して補償に使用する。
カクテル中の各抗体の1マイクロリットルをビーズを含む各チューブに1マイクロリットル加え、各生存性染色補償制御チューブに1マイクロリットルの生存性染色剤を加えます。光から保護された摂氏4度で20分後、チューブあたり1ミリリットルのPBSでサンプルを洗浄し、1チューブあたり新鮮なPBSの250マイクロリットルでペレットを再中断します。BALセルの非染色対照サンプルをフローサイトメーターにロードし、補償マトリックスを設定します。
次にサンプルチューブをロードし、低圧で細胞をソートし、ノイズを除外し、生細胞およびCD45陽性細胞を含み、ダブレットを除外する。より大きな骨髄系の母集団の中で、CD206およびCD169二重陽性細胞を肺胞マクロファージとして並べ替える。小さなリンパ球集団内で、CD3陽性細胞を単離し、CD4およびCD8単一陽性集団を選別する。
末梢血単核細胞試料を並べ替えるために、ゲートは、ノイズおよびダブレットを除外し、実証されるように生きたCD45陽性細胞を含む。CD3をゲーティングした後、CD3陰性、CD14陽性細胞をゲートして単一陽性単球を選別し、CD3陽性、CD4、およびCD8陽性細胞をゲートして、両方の単一陽性集団を選別します。BAL全体のサンプルを数えるとき、より大きい丸いマクロファージおよびより小さく、丸いリンパ球を含む異なった細胞タイプを視覚化することができる。
マクロファージはBAL液中で最も豊富な細胞型であり、非喫煙者肺の細胞の約85%を占める。これらの細胞は、ほとんど排他的に見えるほど喫煙者に富んでおり、非喫煙者で観察されたマクロファージと比較して約40%拡大する傾向がある。BAL流体サンプルから肺胞マクロファージを選別するために用いられるマーカーは、貪食細胞およびシアロシェシン受容体CD169に存在するマンノース受容体CD206のような肺胞マクロファージの以前に記載された表現型に基づいて選択された。
その分離後、肺胞マクロファージおよび他の細胞タイプは、フローサイトメトリー、免疫学的機能アッセイ、または超高感度PCRによるリザーバ定量による免疫整型に使用することができる。この技術は、歴史的に達成することが困難であった非常に純粋な組織居住マクロファージへのアクセスを可能にし、重要な免疫細胞集団の以前に達成不可能な検査を可能にする。
