我々は図3の使用のためYutianガンに感謝。スミスカレッジブレークスリー、Wilensとホームズの資金;、ハワードヒューズ医学研究所は、この作品は、全米科学財団0420971によってサポートされていました。

1。サンプルの準備<ol><li>出発原料としてのマウスから新鮮、瞬間凍結あるいはRNAlaterで処理した組織を使用してください。続行する前にキムワイプで余分な防腐剤を離れて覆い隠す。 </li><li>筋肉の周りのすべての腱や筋膜を取り出して、組織がうまくみじん切りまたは粉状になるまで低温室（4℃）で冷やしたガラス板上で2分間、単一の両刃カミソリの刃で組織をミンチ。あらかじめ計量した微量遠心チューブにサンプルを収集し、組織の重量を決定する。あなたの出発原料としての組織の10以上のミリグラムを使用してください。 </li><li>室温で、1 mgのみじん切り組織あたり45μLの抽出バッファー（8M尿素、50mMのDTT、4％CHAPS、0.2％キャリアの両性電解質5 / 8、0.0002パーセントブロモフェノールブルー）を追加します。ボリュームが350μLを超える場合は、最初に350μLを追加し（ステップ1.4）、ホモジナイズし、水はねを最小限に抑えるために、バッファの残りを加える。 </li><li> 15秒のために組織の電動乳棒（Kontesコーポレーション）で7回ホモジナイズで4℃、2分ごとに均質化の間に氷上で冷却しながら。 </li><li> 4℃で30分間15600 × gでサンプルを遠心℃に上清を保存し、その体積を測定する。細胞破片ペレットは破棄されます。 </li><li>氷冷試薬グレードのアセトン（：V比3倍v）で上清中のタンパク質を沈殿させる。 15秒間ボルテックスチューブを。 10秒間15600 XGのための遠心ペレットを形成し、Kontesモーターとポリプロピレン攪拌棒（BioSpec PROD）で抽出緩衝液に懸濁するために</li><li>ステップ1.6を​​繰り返します。 </li><li>どちらの試料のタンパク質濃度の推定を続行または-20℃で保管して</li></ol> 2。タンパク質濃度の推定約4.5 mgをml -1のための目的は、ローリーアッセイ7またはBCAアッセイ8（Pierce）を使用してください。 3。等電点電気泳動<ol><li> ReadyStrip IPGストリップ（11 cmのpHを5-8、Bio - Rad）を削除する-20 ° Cから、それが10〜15分間室温で平衡化することができます。 </li><li>渦サンプルの補水トレイ内のチャネルのバックエッジにある直線のタンパク質サンプルのサンプルやピペット600から800μgの（総体積200μL）、各端で約1cmを残して。 </li><li> IPGストリップのプラスチックカバーを剥がし、ピンセットを用いて - ストリップの端の部分だけを処理し、ゲルとの接触を避けるために確認してください。ストリップの基本的な終わりをメモし、トレイの左側に配置します。サンプルの上にIPGストリップゲル面を下に置く、下に気泡をトラップすることは避けてください。それが1時間溶解することができます。 </li><li> 2.5 mlのミネラルオイル（バイオラッド）とオーバーレイ。蓋付きのトレイをカバーし、そして室温で一晩水和するために残す。 </li><li>フォーカシングトレイのチャネルと10μLミリポア水とウェットそれぞれの両端に紙の芯を置きます。 </li><li> IPGストリップを取り出し、ドレインを約10秒間垂直に油を保持する。プラスチック製のBにしみキムワイプで肯定応答（ACK）。 </li><li>フォーカシングトレイの下と左に基本的なエンドとIPGストリップのゲル面を置きます。 2.5 mlのミネラルオイルをストリップをカバー。 </li><li>プロティアンIEFセル（Bio - Rad社）とプログラム20のデフォルトのセルの温度で3ステップのプロトコール（表1）にトレイを置く° C、50μA/ストリップ、無補水時の最大電流。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td>電圧が</td><td>タイム</td><td>電圧時間</td><td>ランプ</td></tr><tr><td>ステップ1 </td><td> 250 </td><td> 20分</td><td></td><td>リニア</td></tr><tr><td>ステップ2 </td><td> 8000 </td><td> 2.5時間</td><td></td><td>リニア</td></tr><tr><td>ステップ3 </td><td> 8000 </td><td></td><td> 4万</td><td>急速な</td></tr><tr><td>総</td><td></td><td> 6.5時間</td><td> 4万</td><td></td></tr></tbody></table>表1。ストリップをIPGの11センチメートル用プロティアンIEFセルの三段のプロトコル。 </li><li>鉗子を用いてIEFセルからIPGストリップを取る。キムワイプとプラスチック製のバッキングをブロットおよびクリーンな水分補給トレイにIPGストリップのゲル面を上に置きます。あなたは、水分補給トレイをカバーしてあるプラスチックのラップと店舗でそれをラップすることができます - 80 ° Cまたは進みます。 </li></ol> 4。 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動<ol><li> 11センチメートル平衡トレイにストリップ（ゲル面を上に）転送する。 </li><li>チャネルに縮小バッファ（6 M尿素、2％SDS、0.05 Mトリス/ HCl pHは8.8、20％グリセロール、2％DTT）4 mLを加え、軽度の振とうしながら10分間ストリップを平衡化します。 </li><li>縮小バッファを削除し、アルキル化バッファー（6M尿素、2％SDS、0.05 Mトリス/ HCl pHは8.8、20％グリセロール、2.5％ヨードアセトアミド）4 mLを加え、軽度の振とうしながら10分間ストリップを平衡化します。 </li><li> STRIを浸漬することによりIPGストリップをすすぐ1 X SDSランニングバッファー（25mMトリス、192mMグリシン、0.1％SDS、pHは8.2）でpが簡単に。 </li><li> 11センチメートル基準プレキャスト10.5パーセント-14％のTris - HCl SDSポリアクリルアミドゲル（Bio - Rad社）のバックプレートにストリップのゲル面を上に置き、それをSDSゲルに完全に密着するように軽く押し込みます。に気泡が2つのゲル表面間に閉じ込めされていないことを確認してください。 </li><li>溶融アガロース溶液の1 mL（0.5％アガロース、25mMトリス、192mMグリシン、0.1％SDS、ブロモフェノールブルー）とIPGストリップをオーバーレイし、アガロースは5分間凝固させる。 </li><li>シングルだけでなく、分子量標準に：タンパク質マーカー10から225 kDaの（76740 USB、P / N）の5μLをロードする。 </li><li>室温で200Vでまたは電気泳動を監視するためにブロモフェノールブルー色素のフロントの移行を使用して低温室（4℃）でのSDSバッファー（25mMトリス、192mMグリシン、0.1％SDS、pHは8.2）でゲルを実行します。 </li><li>プラスチックキャストからゲルを取り出して、クマシーブリリアントブルーで穏やかに振とうして一晩染色染色R - 250（45.5％メタノール、45.5パーセントdH2O、9.0％酢酸、0.25％クマシーブリリアントブルーR - 250）。 </li><li> 3時間一晩それぞれと脱色2の（5％メタノール、90％のdH 2 O、5％酢酸）のために二度脱色1溶液（45.5％のメタノール、45.5パーセントのdH 2 O、9.0％酢酸）でゲルを振る。分析のための7％酢酸でゲルを保管してください。 </li></ol> 5。ゲルイメージングと解析<ol><li> VersaDocイメージングシステム（BioRad）を動作する数量Oneソフトウェアプログラムを使用してゲルの画像をキャプチャ。あなたの実験ですべてのゲルの均一画像領域をトリミング。 </li><li>実験セットを作成するPDQuest 8.0ソフトウェアのプログラム上のトリミングされた画像を読み込む。スポットの検出とゲル間マッチングスポットのパラメータを定義するために実験のセットアップウィザードに従ってください。必要に応じて手動で結果が一致する点を点検し、洗練する。 </li><li> TWと一致するタンパク質スポットを検出するためにゲルの定量的および統計的分析を実行twoゲル群間の発現のo倍以上統計的に有意な差。興味のこれらのスポットに設定された分析を作成し、トリプシン消化し、LC - MSベースのタンパク質同定のためEXQuestスポットカッター（BioRad）を用いて、それらを切り取ります。 </li></ol> 6。ゲル内トリプシン消化このステップのために変更されたピアースゲル内トリプシン消化キット（＃89871X、ピアース）プロトコルが使用されます。 <ol><li>ゲルプラグに脱色溶液200μL（25 mM重炭酸アンモニウム、50％アセトニトリル）を追加します。渦とで37サンプルをインキュベートします振とうしながら30分間。慎重に液を除去し捨てる。 </li><li>ステップ6.1を繰り返します。 </li><li>作りたての削減バッファー（50mM Tris [2 - カルボキシエチル]ホスフィン、22.5 mM重炭酸アンモニウム）10分間60℃でゲルプラグとインキュベーションを含むチューブに。30μLを追加</li><li>試料を冷却して、その後減少させるバッファを削除し、破棄する。</li><li>アルキル化緩衝液（100mMヨードアセトアミド、20mMの重炭酸アンモニウム、アルミホイルに包まれた管で、使用直前に準備の30μLを加える。1時間室温で暗所でサンプルをインキュベートする。 </li><li>アルキル化バッファを削除し、破棄する。各チューブへのソリューションを脱色の200μLを加えることによりゲルプラグを洗浄してください。 37サンプルをインキュベート℃で15分間。 </li><li>取り外して廃棄脱色ソリューションをして洗浄を繰り返します。 </li><li>ゲルプラグにアセトニトリル50μLを追加し、それらが乾燥収縮するために室温で10分間それらをインキュベートして、慎重にアセトニトリルを削除します。 </li><li>もう一度手順6.8を繰り返します。ゲル片は、白と小さいはずです。 </li><li>ゲル片を10分間Centrivapコンセントレータ（Labconco、モデルEX1245）で乾燥することができます。 </li><li>活性トリプシン溶液（10 ng /μLのトリプシン、25 mM重炭酸アンモニウム）の10μLを加えることによりゲル片を膨潤。 15メートルのために室温でインキュベートinutes。 </li><li>チューブに25μLの消化緩衝液（25 mM重炭酸アンモニウム）を追加します。振盪しながら室温で一晩サンプルをインキュベートする。 </li><li> 10分間、サンプルを超音波処理（ブランソン、バスの超音波処理のモデル2510）と新しい​​チューブに上清を除去する前にそれらをスピンダウン。上清を保存します。 </li><li>さらにペプチドを抽出するには、振とうしながら室温で5分間0.1％ギ酸とインキュベートの10μLを加える。 、10分間サンプルを超音波処理して上清を収集し、ステップ6.13で保存した上清と組み合わせる。 </li></ol> 7。ペプチド抽出物のマイクロ脱塩<ol><li>重炭酸アンモニウムと製造業者の指示に従ってPepClean C - 18スピンカラム（ThermoFisher）の助けを借りて、ペプチド抽出物中の他の塩を取り外します。 </li><li> 20μLの70％アセトニトリルで2回溶出するペプチドは、1時間と再懸ためC​​entrivapコンセントレータで遠心分離により乾燥した試料を蒸発させるMS分析のための10μL0.1％ギ酸中のペプチド。 </li></ol> 8。 HPLC -結合質量分析によるタンパク質同定<ol><li> PepswiftモノリシックPS - DVBコラム（ダイオネクス）に0.2％ギ酸で線形2から50パーセントのアセトニトリル勾配を用いて40分以上の高速液体クロマトグラフ（HPLC）でのペプチド混合物の別の5μLは、ナノスプレーに結合I先端で400 NL / minの流量でイオントラップ型質量分析計（LCQデカXPマックス、サーモフィッシャーサイエンティフィック）上にソース。 </li><li> 400〜ペプチドMS1信号検出 - 1400のm / zをし、動的な除外とCIDによってMS2配列決定のために分離する3最も強いイオンピークを可能にする。 </li><li>タンパク質同定のために、静的なアルキル化システイン修飾とリン酸化のための動的な変更（セリン、スレオニン、チロシン）、methylaとSEQUESTのマウスのリファレンスデータベース検索（BioWorksソフトウェア、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を介してペプチドの結果を分析る（ヒスチジン）、酸化（メチオニン）、ADP -リボシル化（アルギニン）、およびN末端アセチル化。保守的な照合基準（例えば、タンパク質はxcorrは対充電状態のフィルタを通過する少なくとも2つのペプチドを含む2 AMU及び1.00フラグメントの許容値に設定されたペプチド耐性を適用する[Z = 1 / X = 1.5、Z = 2 / X = 2.00、Z = 3 / X = 2.50、Z = 4 / X = 3.00]、pの確率&lt;0.05）5、手動で自信を持ってタンパク質同定のためのMSスペクトルを調べる。 </li></ol> 9。代表的な結果： 男性と女性の未行使、マウス骨格筋（上腕二頭筋）は二次元マップ5、筋肉の比較プロテオーム（図2）の最初のレベルに抽出して分離した。かつて高解像度のデジタル画像を用いて可視化、約800のタンパク質スポットは、それぞれに検出された。ベースラインとして男性のプロテオームマップを使用して、それはその女性のプロテオームにおける存在量の変化を多数の斑点があることは明らかです。スポットの強度は<html>タンパク質量の変化（図3）の措置。 N = 5マウス持つ（アップまたはダウン）つ以上倍を変更と統計的に有意であるタンパク質スポットのアイデンティティ（P &lt;0.05は）、液体クロマトグラフィ-共役質量分析計を用いアミノ酸配列分析によって決まります。これらの結果は、雌が砂糖のエネルギー代謝の酵素で、クレアチンキナーゼの酵素（CK）アイソフォームの存在量の減少、筋肉の別のエネルギー供給システムを実証することを示している。人間と動物の両方が残りと次の演習9,10に高雄の血清CKレベルを表示しますが、血清CKレベルは必ずしも筋原線維の崩壊11,12の量と相関関係はありません。マウス上腕二頭筋のCKの細胞の存在量のこの男女の二型性は、小説finding5であり、生理学的に異なる血清CKレベルを答えることができる。 図： g1.jpg&quot;/&gt; 図1比較プロテオミクスのためのプロトコルの全体的な概略図。 、サンプルの分析、および、タンパク質同定試料調製：プロトコルは3つのグループに分割されます。全体的なプロトコルは停止せずに実施されている場合、最良の結果を獲得しているものの、プロトコルのこれら3つのグループのそれぞれの両端には、また、合理的な一時停止の場所です。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig2.jpg" /> 図2：女性のマウス上腕二頭筋蛋白質の比較は、男性の上腕二頭筋における同一箇所（緑の円O）に対して相対的スポット。以上の女性の2倍に等しいの増加スポットは、赤色（O）の円で囲まれており、より小さいまたは2倍に等しいを減少するものは、青（O）を円で囲まれて。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig3.jpg" /> 図3ゲルのスポットの強度解析：X軸、メス運動前（コントロール、N = 5）、Y軸、0時間の時点の群（n = 5）試合女子シングル。回帰直線：相関係数= 0.919、傾き= 0.976、切片= -0.0293。二倍 - 赤線の上の青い線の下のスポットは、+ /以上に変更。

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利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介するLC / MSプロテオミクスの方法は、骨格筋のプロテオームの最初のレベルを迅速に解析するための最も信頼性と再現性のプロトコルです。それは、ジェンダーの特異性の合理的便宜を比較することができます。低濃度のタンパク質は、筋肉のサンプルの分画は、それによって低濃度のタンパク質を増加させる、可能な限り収縮タンパク質のような多くを除去するために必要になります。必要に応じて、プロテオームプロフィールを自分好みに仕立てる異なるpH範囲のIPGストリップと代替割合の勾配ゲルで行うことができます。より多くの感受性蛍光染色は存在するが、我々は、各研究室では、システム内のこれらの汚れの直線性を決定することをお勧めします。タンパク質発現のより厳密な分析のためDIGEシステム（二次元電気泳動システム - ゲル法では、GEヘルスケアバイオサイエンス）を使用することができるが、しかし、これは方法論に複雑さのレベルを追加しません。さらに、ここに記述されたプロトコルは、ほとんどのANIを使用することができます重複する酵素断片がほかに高純度の酵素を使用して生成することができるので、ゲノムが同様に任意のソースからの蛋白質のde novoシーケンスとして、配列されている熱の組織は、限りそれは、二次元ゲル上で分離することができますトリプシンに。膜と疎水性タンパク質を探して、しかし、我々は心臓、肝臓、腎臓および脳組織では、このプロトコルを使用して良い結果を持っている場合は特に、他の組織源からのサンプルは、抽出の方法論におけるいくつかの変化が必要になる場合があります。他の翻訳後修飾は、マススペクトルデータベースの検索条件を変更することによって検出することができる。要するに、我々はプロテオームプロファイリング解析のための合理的に詳細な初期プロトコルを提示している。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>タイプ</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> PepClean C - 18スピン カラム</td><td>消耗品</td><td> ThermoFisher 科学</td><td> PI - 89870 </td><td></td></tr><tr><td>モノリシックPepswift カラム（100um × 5センチ） </td><td>消耗品</td><td>ダイオネクス</td><td> 162348 </td><td></td></tr><tr><td>基準プレキャスト 10.5パーセント-14％のTris - HCl SDS ポリアクリルアミドゲル</td><td>消耗品</td><td> BioRad社</td><td> 345-0106 </td><td></td></tr><tr><td> IPGストリップをReadystrip </td><td>消耗品</td><td> BioRad社</td><td> pHを変化 レンジ</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>試薬</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> A465 - 1 </td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>試薬</td><td> Pharmco </td><td> 329000 </td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>試薬</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> A955 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td>試薬</td><td> BioRad社</td><td> 163-2111 </td><td>オーバーレイ のソリューション</td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>試薬</td><td>フルカ</td><td> 40867 </td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>試薬</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP114 </td><td></td></tr><tr><td>バイオLyteの両性電解質</td><td>試薬</td><td> BioRad社</td><td></td><td> pHを変化 レンジ</td></tr><tr><td> CHAPS </td><td>試薬</td><td> USB </td><td> 13361 </td><td></td></tr><tr><td> CommassieブルーR - 250 </td><td>試薬</td><td> ThermoFisher 科学</td><td> 20278 </td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール（DTT） </td><td>試薬</td><td> USB </td><td> 15395 </td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>試薬</td><td> ThermoFisher 科学</td><td> 28905 </td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>試薬</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G6279 </td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>試薬</td><td> USB </td><td> 16407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>試薬</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> I6125 </td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>試薬</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> A452 </td><td></td></tr><tr><td>鉱油</td><td>試薬</td><td> BioRad社</td><td> 163-2129 </td><td></td></tr><tr><td>硫酸ドデシルナトリウム</td><td>試薬</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td>トリス塩基</td><td>試薬</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 93349 </td><td></td></tr><tr><td>トリス[2 - carboexyethyl] ホスフィン</td><td>試薬</td><td> ThermoFisher 科学</td><td> 77720 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシンエンドプロテイナーゼ、 治療TPCK、MSグレード</td><td>試薬</td><td>ピアース</td><td> 90055 </td><td>変更</td></tr><tr><td>尿素</td><td>試薬</td><td> USB </td><td> 75826 </td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>試薬</td><td>バーディック＆ ジャクソン</td><td> 365 </td><td></td></tr><tr><td> Centrivapコンセントレータ</td><td> TOOL </td><td> Labconco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Exquestスポットカッター</td><td>ツール</td><td> BioRad社</td><td></td><td></td></tr><tr><td> LCQデカXPマックスイオン トラップ型質量分析計</td><td>ツール</td><td> ThermoFisher 科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電動乳棒</td><td>ツール</td><td> Kontesコーポレーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>攪拌ポリプロピレン</td><td>ツール</td><td> BioSpecは突く</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロッド</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロティアンIEFセル</td><td>ツール</td><td> BioRad社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター</td><td>ツール</td><td>ブランソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーベイヤープラスHPLC システムの</td><td>ツール</td><td> ThermoFisher 科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td> VersaDocイメージング システムの</td><td>ツール</td><td> BioRad社</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

skeletal muscle gender dimorphism from proteomics

骨格筋の総収縮は、主に収縮タンパク質の比較的小さな数によって決定されますが、この組織はまた、廃用による抵抗運動と萎縮によって肥大などの環境要因1〜非常に適応可能です。それは、それによってストレッサー（熱、虚血、重金属、 など 。）2,3に改造し、適応を示す。 、いわゆる伸張性収縮の4を長くしながら、ダメージは筋力発揮する力が筋肉に発生する可能性があります。収縮タンパク質は、そのようなexertionsに損傷や劣化及び/または再合成、修復する必要があることができ、これらの関数は、収縮タンパク質の一部ではないが、セル内の他のはるかに少ない種類のタンパク質で構成。差を決定するタンパク質のサブセットが損傷のこのタイプの改善に関与しているかを判断するには、グローバルなプロテオームは5を行使する前に確立されている必要がありますし、練習に続いて続いてタンパク質の発現と、それによって損傷とその修復の適応での候補タンパク質を強調表示します。さらに、骨格筋のほとんどの研究は、種のオスで実施されており、それ故に女性の筋肉の代表的な場合があります。 この記事では、男性と女性の筋肉から、再現性のタンパク質を抽出し、高解像度デジタル画像6で続いて二次元ゲル電気泳動によって、それらを分離する手法を提案する。これは統計的に有意（p &lt;0.05）に2倍の増加または減少、コントロールの状態から、表示または非表示。示しスポット（およびその後のタンパク質を同定）するためのプロトコルを提供します。これらはその後、摘出トリプシンで消化し ​​、タンパク質同定のための質量分析計（LC / MS）（LC / MS / MS）5に結合し、高圧液体クロマトグラフィーによって分離されています。この方法論（図1）（肝臓、脳、耳のない変更がほとんどで、多くの組織で使用することができますトンなど 。）。

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Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

分離して骨格筋に発現し、最も豊富なタンパク質の同一性を決定するための方法の直接的なセット。約800スポットが10 mgの筋から二次元ゲル上に明察しているが、これは性別特異的タンパク質の発現の判定が可能になります。これらのメソッドは、ほとんどの組織で同等の結果が得られます。

プロテオミクスから骨格筋の性別二型

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

skeletal-muscle-gender-dimorphism-from-proteomics

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12.4K ビュー.  Smith College. 分離して骨格筋に発現し、最も豊富なタンパク質の同一性を決定するための方法の直接的なセット。約800スポットが10 mgの筋から二次元ゲル上に明察しているが、これは性別特異的タンパク質の発現の判定が可能になります。これらのメソッドは、ほとんどの組織で同等の結果が得られます。

ビデオ: Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

単離骨格筋のミオ - 機械的分析

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

医学

Tibial Nerve Transection - A Standardized Model for Denervation-induced Skeletal Muscle Atrophy in Mice

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. Although originally developed and used extensively in the rat due to its larger size, the tibial nerve in mice is big enough that it can be easily manipulated with either crush or transection, leaving the peroneal and sural nerve branches of the sciatic nerve intact and thereby preserving their target muscles. Thus, this model offers the advantages of inducing less morbidity and impediment of ambulation than the sciatic nerve transection model and also allows investigators to study the physiologic, cellular and molecular biologic mechanisms regulating the process of muscle atrophy in genetically engineered mice. The tibial nerve supplies the gastrocnemius, soleus and plantaris muscles, so its transection permits the study of denervated skeletal muscle composed of fast twitch type II fibers and/or slow twitch type I fibers. Here we demonstrate the tibial nerve transection model in the C57Black6 mouse. We assess the atrophy of the gastrocnemius muscle, as a representative muscle, at 1, 2, and 4 weeks post-denervation by measuring muscle weights and fiber type specific cross-sectional area on paraffin-embedded histologic sections immunostained for fast twitch myosin.

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of skeletal muscle atrophy. The model surgical protocol is described and demonstrated in C57Black6 mice. &#160;

脛骨神経切断 - マウスにおける脱神経誘発性骨格筋萎縮のために標準化されたモデル

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

変更されたベルイストローム法を用いたヒト骨格筋生検手順

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of living systems. Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using qMRI methods. The MRI acquisition protocol begins with localizer images (used to locate the position of the body and tissue of interest within the MRI system), quality control measurements of relevant magnetic field distributions, and structural imaging for general anatomical characterization. The qMRI portion of the protocol includes measurements of the longitudinal and transverse relaxation time constants (T1 and T2, respectively). Also acquired are diffusion-tensor MRI data, in which water diffusivity is measured and used to infer pathological processes such as edema. Quantitative magnetization transfer imaging is used to characterize the relative tissue content of macromolecular and free water protons. Lastly, fat-water MRI methods are used to characterize fibro-adipose tissue replacement of muscle. In addition to describing the data acquisition and analysis procedures, this paper also discusses the potential problems associated with these methods, the analysis and interpretation of the data, MRI safety, and strategies for artifact reduction and protocol optimization.

Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using non-invasive magnetic resonance imaging methods.

骨格筋疾患の定量的磁気共鳴イメージング

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is estimated to contribute to 19- 25% of all clinical cases of acute kidney injury (AKI) in critically ill patients. AKI detection has historically relied on metrics such as serum creatinine (sCr) or blood urea nitrogen (BUN) which are demonstrably inadequate in full assessment of nephrotoxicity in the early phase of renal dysfunction. Currently, there is no robust diagnostic method to accurately detect hemodynamic alteration in the early phase of AKI while such alterations might actually precede the rise in serum biomarker levels. Such early detection can help clinicians make an accurate diagnosis and help in in decision making for therapeutic strategy. Rats were treated with Cisplatin to induce AKI. Nephrotoxicity was assessed for six days using high-frequency sonography, sCr measurement and upon histopathology of kidney. Hemodynamic evaluation using 2D and Color-Doppler images were used to serially study nephrotoxicity in rats, using the sonography. Our data showed successful drug-induced kidney injury in adult rats by histological examination. Color-Doppler based sonographic assessment of AKI indicated that resistive-index (RI) and pulsatile-index (PI) were increased in the treatment group; and peak-systolic velocity (mm/s), end-diastolic velocity (mm/s) and velocity-time integral (VTI, mm) were decreased in renal arteries in the same group. Importantly, these hemodynamic changes evaluated by sonography preceded the rise of sCr levels. Sonography-based indices such as RI or PI can thus be useful predictive markers of declining renal function in rodents. From our sonography-based observations in the kidneys of rats that underwent AKI, we showed that these noninvasive hemodynamic measurements may consider as an accurate, sensitive and robust method in detecting early stage kidney dysfunction. This study also underscores the importance of ethical issues associated with animal use in research.

Early stage hemodynamic dysfunction is critical to the development of kidney disease. Yet, detection methodologies are limited. Recent advances in sonography provide a noninvasive, accurate option for early detection of kidney injury. This study outlines a step-by-step, sonographic methodology for detecting kidney dysfunction using a drug-induced nephrotoxicity rat model.

ラットにおける超音波検査技術を用いた薬剤誘発性腎血行動態機能障害の早期発見

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy. 
During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS). 
The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography. 
The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

マウスの圧負荷モデルを用いた冠動脈の流れと冠血流準備の超音波ベースのアセスメント

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

人間<em&gt;外側広筋</emワイル・ブレークスリーConchotomeを使用&gt;骨格筋生検

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery in humans. Herein we discuss the design of an eccentric exercise protocol to induce damage in the quadriceps muscles, marked by changes in strength, soreness, and plasma creatine kinase levels. This method is simple, ethical, and widely applicable since it is performed in human participants and eliminates the interspecies translation of the results. Subjects perform 300 maximal eccentric contractions of the knee extensor muscles at a speed of 120&#176;/sec on an isokinetic dynamometer. The extent of the damage is measurable using relatively non-invasive isokinetic and isometric measures of strength loss, soreness, and plasma creatine kinase levels over several days following the exercise. Therefore, its application can be directed to specific populations in an attempt to identify mechanisms for muscle adaptation and regeneration.

This article describes a safe and reliable method to induce and quantify exertional skeletal muscle damage in human subjects.

ヒトにおける労作骨格筋損傷の誘導および評価

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery ...