著者らは、ウルフ・ディーター・スターツ博士、アルノー・レミー博士、アントン・ポッシュ博士、パトリシア・ピアッティ博士、トム・デイヴィス、クリス・シモニー、ジェフ・ダーバンがこの原稿の批判的なレビューと編集に感謝しています。著者らはまた、アリソン・シュワルツの技術サポートに感謝しています。

1. タンパク質サンプルの準備
(細胞培養からタンパク質を抽出する一般的な手順について説明します)
<ol><li>氷の中にHeLa細胞培養皿を置き、氷冷トリス緩衝生理食酒(TBS;20 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl)で細胞を洗います。</li>
	<li>TBSを吸引し、100mm皿の氷冷RIPAバッファー(50 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1%NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS)にホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を加えます。</li>
	<li>冷たいプラスチックセルスクレーパーを使用して、皿から接着細胞を削り取ります。細胞懸濁液を予冷したマイクロ遠心チューブにそっと移します。</li>
	<li>回転器の4°Cで30分間一定の撹拌を維持する。</li>
	<li>4°Cの予冷遠心分離機で20分間16,000 x gでスピンします。</li>
	<li>遠心分離機からチューブをそっと取り出し、氷の上に置きます。上清を氷の上に置いた新鮮なチューブに移し、ペレットを捨てます。</li>
	<li>タンパク質アッセイを行うために、少量のリセート(10~20 μl)を除去します。RC DCアッセイキットを用いて、各サンプルのタンパク質濃度を決定します。</li>
	<li>必要に応じて、タンパク質サンプルを-20°Cで長期保存する。 凍結と解凍サイクルを繰り返すとタンパク質の分解を引き起こし、避けるべきです。</li>
	<li>各サンプルの約20 μgを取り、2xレムミリサンプルバッファー(4%SDS、10%2メルカプトエタノール、20%グリセロール、0.004%ブロモフェノールブルー、125 mM Tris-HCl、pH 6.8)の等量を加えます。</li>
	<li>各細胞のライセートを95°Cのサンプルバッファーで5分間加熱します。</li>
	<li>マイクロ遠心分離機で16,000 x gの遠心分離機を1分間用いた。</li>
</ol>2. 染色フリーゲルを用いたゲル電気泳動(30分)
<ol><li>基準TGX任意のKD染色フリープレキャストゲル(ミディフォーマットゲル)を取り、カセットの底から櫛とテープを取り外します。</li>
	<li>カセットを基準セルに入れ、統合された上部バッファーチャンバーに60 mlのランニングバッファ(25 mMトリス、190 mMグリシン、0.1%SDS、pH 8.3)を充填します。ランニングバッファで井戸をすすいします。</li>
	<li>400 ml のランニングバッファを備えた下のバッファータンクの半分を、マークされた充填ラインに充填します。</li>
	<li>タンパク質サンプルと適切なタンパク質マーカーをロードします。</li>
	<li>タンクに蓋を置き、色分けされたバナナプラグを蓋の上の対応するジャックと位置合わせします。</li>
	<li>ゲルを200Vで~30分間、300Vで20分間動かします。</li>
</ol>3. ケミドックMPシステムを用いた染色を含まないゲルイメージングでタンパク質分離品質を確認(~5分)
<ol><li>ゲルカセットを細胞から取り出します。基準セル蓋のゲルカセット開口ツールを使用してカセットを開け、ゲルを放出します。</li>
	<li>ChemiDoc MPイメージャーのUVサンプルトレイの中心に水のカップルを適用します。慎重にカセットからゲルを持ち上げ、トレイの上に置きます。</li>
	<li>イメージラボソフトウェアを起動し、次の設定で、染色のないゲルイメージ(図1A)をキャプチャします。 用途:無染色ゲル ゲル活性化時間:1分 イメージング領域:基準ゲル 画像露出時間:最も強烈なバンドに自動的に最適化</li>
	<li>サンプルトレイからゲルを取り出し、すぐに転送ステップに進みます。</li>
</ol>4. トランスブロットターボシステムによるタンパク質の移動(10分)
<ol><li>トランスブロットターボミディPVDF転送パックを開きます。転写カセットの基部に底面の積み重ね(膜を含む)を置きます。</li>
	<li>ゲルを膜の上に置き、上部のスタックをゲルの上に置き、泡をロールアウトします。</li>
	<li>カセットベースに蓋を置き、ダイヤルを回してロックします。</li>
	<li>カセットをブロッターベイに挿入します。</li>
	<li>プリセットターボプログラムを選択し、基準ゲルサイズ(MIDI)を選択して転送を開始し、RUNキーを押します。典型的な走行時間はわずか7分です。</li>
	<li>転写が終わったら、ブロッティングサンドイッチを分解し、ブロットとゲルの両方を脱イオン水で容器に入れます。</li>
</ol>5. ケミドックMPシステムを用いた染色不要ゲルおよびブロットイメージングによるタンパク質転写効率と品質の確認(~5分)
<ol><li>トランスファー後ゲルをケミドック MP イメージャーのサンプルトレイに置きます。</li>
	<li>Image Labソフトウェアを起動し、次の設定で転写後ゲルの染色のないイメージ(図1B)をキャプチャします。 用途:無染色ゲル ゲル活性化時間:なし イメージング領域:基準ゲル 画像露光時間:予写ゲル画像の露光時間と同じ</li>
	<li>サンプルトレイからゲルを取り出し、次の設定でブロット(図1C)をイメージします。イメージング時に水またはTBSTの数滴で濡れたブロットを保ちます。 アプリケーション:汚れのないブロット イメージング領域:基準ゲル 画像露出時間:最も強烈なバンドに自動的に最適化</li>
	<li>サンプルトレイからブロッティング膜を取り出し、TBST(TBSで0.1%Tween 20)の容器に入れます。</li>
</ol>6. 抗体インキュベーション
<ol><li>ブロックは、1時間の部屋温度でTBSTで3%ウシ血清アルブミン(BSA)の溶液にブロットを配置することによって。</li>
	<li>第1の標的タンパク質に対して上げられたマウス一次抗体およびウサギ一次抗体に対して第2の標的タンパク質に対して上昇したマウス一次抗体を含む溶液中の4°Cで一晩ブロットをインキュベートする。</li>
	<li>一次抗体を含む溶液を注ぎ出す。次に、20mlのTBSTで5分間撹拌してブロットを洗います。合計 5 回の操作で 4 倍の操作を繰り返します。</li>
	<li>Dylight 650コンジュゲートヤギ抗マウス抗体とDylight 549共役ヤギ抗ウサギ抗体を含む二次抗体溶液中の室温で1時間インキュベート。</li>
	<li>一次抗体を含む溶液を注ぎ出す。次に、20mlのTBSTで5分間撹拌してブロットを洗います。合計 5 回の操作で 4 倍の操作を繰り返します。</li>
</ol>7. 画像実験ソフトウェアによるイメージングとデータ解析- 全タンパク質正規化(~5分)
<ol><li>新しいマルチチャンネルプロトコルを開いてブロットの蛍光画像(図1E)を多重化して取得し、3つの蛍光チャネルを設定してプロトコルを実行します。 チャンネル1: アプリケーション:ブロットダイライト650 イメージング領域:基準ゲル 画像露出時間:最も強烈なバンドに自動的に最適化 チャンネル2: アプリケーション:ブロットダイライト549 イメージング領域:基準ゲル 画像露出時間:最も強烈なバンドに自動的に最適化 チャンネル3: アプリケーション:汚れのないブロット イメージング領域:基準ゲル画像露光時間:最も強いバンドに対して自動的に最適化</li>
	<li>[解析] ツール ボックスの [正規化] アイコンをクリックし、[はい] をクリックして車線とバンドを検出します。</li>
	<li>必要に応じて「レーンとバンド」を選択して、レーンとバンドを調整します。</li>
	<li>正規化チャネルとして、染色のない画像を選択します。</li>
	<li>MW 解析ツールを選択し、MW 標準レーンの下にあるチェックボックスをオンにして、MW 標準レーンを割り当てます。</li>
	<li>正規化されたボリュームを表示するには、ツールバーの[解析テーブル]をクリックします。すべての計算は、正規化係数と正規化されたボリュームを含むソフトウェアによって自動的に実行されます。ターゲットタンパク質バンド強度値は、タンパク質負荷の変動に合わせて調整されるようになりました。これにより、サンプル間の標的タンパク質の正確な比較が可能になります。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+total+protein+stains+as+loading+controls:+an+alternative+to+high-abundance+single-protein+controls+in+semi-quantitative+immunoblotting.">The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting.</a> J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).</li><li>Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+four+housekeeping+proteins+in+elderly+patients+with+schizophrenia.">Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia.</a> J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).</li><li>Casta&#241;o, Z., Kypta, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+Proteins:+Limitations+as+References+During+Neuronal+Differentiation.">Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation.</a> Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).</li><li>Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology.">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li><li>Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+plasma+membrane+Ca-ATPase+and+stromal+interacting+molecule+1+expression+levels+for+Ca2++signaling+in+dystrophic+mdx+mouse+muscle.">Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).</li><li>Dittmer, A., Dittmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-actin+is+not+a+reliable+loading+control+in+Western+blot+analysis.">Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis.</a> Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).</li><li>Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+carnosine+on+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+in+human+skeletal+muscle+fibers.">Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers.</a> J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).</li><li>Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+expression+and+function+of+erythropoietin+receptors+in+the+kidney.">Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).</li><li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li><li>Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+proteins:+a+preliminary+study+illustrating+some+limitations+as+useful+references+in+protein+expression+studies.">Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies.</a> Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+genes;+expression+levels+may+change+with+density+of+cultured+cells.">Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).</li><li>G&#252;rtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stain-Free+Technology+as+Normalization+Tool+in+Western+Blot+Analysis.">Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis.</a> Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).</li><li>Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+SYPRO+Ruby-+and+Flamingo-stained+polyacrylamide+gels+to+Western+blot+analysis.">Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis.</a> Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).</li><li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range.">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).</li><li>Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kowalczykowski+SC+BRCA2+is+epistatic+to+the+RAD51+paralogs+in+response+to+DNA+damage.">Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage.</a> DNA Repair. , (2013).</li><li>Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+reference+proteins+in+human+placenta:+general+protein+stains+are+the+benchmark.">Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark.</a> Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).</li><li>Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+temperature,+oxidative+stress,+and+phosphorylation+on+binding+of+heat+shock+proteins+in+skeletal+muscle+fibers.">Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).</li><li>Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Oligomerization+Disrupting+Mutation+in+CRY&#913;A+Associated+with+Congenital+Cataract+in+a+South+Australian.">Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRY&#913;A Associated with Congenital Cataract in a South Australian.</a> , (2012).</li><li>Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+rice+reference+proteins+for+western+blotting.">Identification and validation of rice reference proteins for western blotting.</a> J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+varies+with+age+in+glycolytic+muscles+of+rats.">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).</li><li>Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-glutathionylation+of+troponin+I+(fast)+increases+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+in+fast-twitch+muscle+fibres+of+rats+and+humans.">S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans.</a> J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).</li><li>Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).</li><li>Neill, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+Data+are+not+created+Equal.">All Data are not created Equal.</a> J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).</li><li>P&#233;rez-P&#233;rez, R., L&#243;pez, J. A., Garc&#237;a-Santos, E., Camafeita, E., G&#243;mez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fern&#225;ndez-Real, J. M., Peral, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+suitable+reference+proteins+for+expression+studies+in+human+adipose+tissue+with+relevance+to+obesity.">Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+Pitfalls+of+Internal+Controls:+Validation+of+Reference+Genes+for+Analysis+by+qRT-PCR+and+Western+Blot+throughout+Rat+Retinal+Development.">Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li><li>Romero-Calvo, I., Oc&#243;n, B., Mart&#237;nez-Moya, P., Su&#225;rez, M. D., Zarzuelo, A., Mart&#237;nez-Augustin, O., de Medina, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+Ponceau+staining+as+a+loading+control+alternative+to+actin+in+Western+blots.">Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots.</a> Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).</li><li>Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+GAPDH+regulation+in+tumor-cells+of+different+origin+under+hypoxic+conditions+in-vitro.">Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro.</a> BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).</li><li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+western+blots.">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots.</a> Exp. 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著者のアントン・ポッシュ、ジョナサン・コーン、ケネス・オー、マット・ハモンド、寧劉はバイオ・ラッド・ラボラトリーズ社の従業員です。

上記のV3染色フリープロトコルは、蛍光ウェスタンブロッティングを多重化するためのものである。また、化学発光検出を用いたウェスタンブロッティングにも適用できる。多重蛍光ウェスタンブロットプロトコルでは、染色のないブロット画像は、2つの時点で取得されます:1)タンパク質の転写直後。2)抗体インキュベーション後の多重蛍光イメージング工程で。第1の染色自由画像は、転写効率を計算するために使用され、第2の染色自由画像は、負荷制御として使用される。化学発光法を適用すると、染色無発光シグナルも染色フリーチャネルに現れるため、染色フリーおよびターゲットタンパク質シグナルの多重化画像を撮ることは不可能です。この場合、タンパク質転写工程直後に撮影した染色のない画像を、ローディング制御および正規化解析に使用することを推奨します。
V3 western ワークフローは、ロード制御としてハウスキーピングタンパク質を使用する従来のウェスタン ブロット ワークフローと比較して、次のような独自の利点を提供します。
まず、V3ワークフローは、実用的で便利で信頼性の高いローディング制御を提供し、目的のタンパク質のレベルの変化を検証します。V3プロトコルは、各サンプルで測定された対象タンパク質のレベルを正規化するために、総タンパク質負荷制御を使用します。これは、ローディングコントロールとしてハウスキーピングタンパク質を使用する2つの落とし穴を回避します: 飽和免疫検出と特定の実験条件下でのサンプル間の一貫性のないハウスキーピングタンパク質の発現レベル。ハウスキーピングに対する抗体を用いたストリッピングとリプロブステップは不要になりました。染色フリー技術を使用すると、タンパク質の全測定にクーマシーやシプロルビーなどの汚れでブロットを汚して脱染色する必要はありません。イメージラボソフトウェアを使用して全タンパク質の正規化を行うには、ブロット画像を取得するのにわずか数秒、約5分かかります。
第二に、V3ワークフローは、手順をより透明にし、品質管理のためのいくつかのチェックポイントを導入するので、科学者が西洋の手順のより良い制御を取ることを可能にします。染色フリー技術の助けを借りて、研究者はゲルとブロットの両方でタンパク質サンプルを視覚化することができます。科学者は、タンパク質サンプルの完全性(分解されたかどうか)、分離品質(沈殿または沈殿しない)、伝達効率と転送品質(転送または転送しない)を評価することができます。これらのチェックポイントは、研究がプロセスに大きな欠陥を見たときに実験を終了し、貧弱なサンプルやブロットに時間を無駄にしないようにするのに役立ちます。この技術はまた、科学者が膜剥離後にかなりの量のタンパク質損失があるかどうか、およびブロットが別の標的 4を再探査するのに適しているかどうかを評価するのに役立ちます。
ここでは、V3 Western ワークフローを使用して優れたエクスペリエンスと品質データを確保するためのヒントをいくつか紹介します。
<ol><li>ゲルを実行した直後にゲルをイメージします。汚れ化合物を洗い流す可能性があるため、手順の最初のイメージングの前にゲルを任意のバッファーに浸漬しないでください。</li>
	<li>同じイメージング領域を使用して、プロトコル内のすべてのイメージを取得します。これにより、ソフトウェアは、総タンパク質正規化などのデータ分析のための画像をオーバーレイすることができます。</li>
	<li>事前転写ゲルと転写後ゲルを撮像する際の露光時間を一貫して保ちます。これにより、ソフトウェアは転送効率を定量的に測定できます。</li>
	<li>ブロット画像を取得する際には、数滴の水またはTBSTで膜を濡らしてください。これにより、標的タンパク質検出に関する汚れた背景の問題を回避できます。</li>
	<li>蛍光性ウェスタンブロッティングの多重化には低蛍光PVDF膜を使用してください。</li>
</ol>UV活性化後の染色を含まない分子はトリプトファン残基に不可逆的に結合することに注意することが重要である。この不可逆的な修飾は、エピトープにトリプトファンが含まれている場合、モノクローナル抗体を使用する場合に抗原認識に影響を与える可能性があります。ポリクローナル抗体は、抗原上の複数のエピトープを認識するため、影響を受ける可能性は低い。結合されていない染色を含まない分子は、ゲルや膜から容易に洗い流されるため、抗体と抗原の相互作用を妨げない。
結論として、V3 Westernワークフローは、ウェスタンブロットプロセスをより速く、より透明で、定量的で信頼性が高くなります。研究者は、ウェスタンブロット実験で総タンパク質負荷制御を簡単に適用して、データをより信頼できるようにすることができます。V3染色フリーのワークフローは、多くのラボで採用されており、その出版物は、ジャーナルがウェスタンブロット22,17,7,8,5,23,18,15のローディング制御として汚れのないデータを受け入れることを実証しています。

ウェスタンブロットは非常に便利な技術9ですが、ウェスタンブロッティングには長くて労働集約的なプロセスとデータの質という2つの大きな課題があります。従来のプロトコルは約2日を要します。サンプル調製、ゲルキャスティング、タンパク質電気泳動および転写、膜遮断、抗体インキュベーション、イメージング、そして非常に頻繁に剥離、再探査、および最後のデータ分析を含む多くのステップが含まれます。このプロセスを通して、プロセス制御のための信頼性と柔軟性のあるツールはありません。そのため、各ステップでエラーが発生する可能性があり、これらのエラーはデータアーティファクトを生成する可能性があります。したがって、ローディングコントロールは、エラーを識別して修正するために、ウェスタンブロッティングで不可欠です。ローディング制御は通常、各サンプルの参照タンパク質のタンパク質レベルをチェックして、それが等しく提示されているかどうかを確認することによって行われます。人々はしばしば、β-アクチン、β-tubulin、GAPDHなどのハウスキーピングタンパク質をローディングコントロールとして使用します。 
ウェスタンブロットデータの品質は、信頼性の高いローディング制御に依存します。しかし、ローディングコントロールにハウスキーピングタンパク質を使用する場合には、2つの正当な懸念があります:1)ハウスキーピングタンパク質バンドの抗体ベースの免疫検出はしばしば飽和しているため、サンプル30の間の負荷の違いを区別することはできません。2)ハウスキーピングタンパク質発現量は、ある特定の実験条件下でサンプル中で変化し得るが、例えば、siRNA処理、細胞死、細胞分化、11、28、3、6、10、21などである。これらの懸念から、科学雑誌は「定量的比較のために、適切な試薬、制御および線形信号範囲を用いるイメージング法を使用すべきである」(Natureガイドライン)を要求している。同様に、臨床調査のジャーナルからの編集者は、より信頼性の高いローディングコントロール24を求めています。これらの理由から、ローディングコントロールとして使用するためにハウスキーピングタンパク質を検証する必要があります。まず、免疫検出方法14,29の線形ダイナミックレンジで測定されていることを確認する必要がある。第二に、すべてのサンプル26,31,25,19,20で一貫して表現されていることを確認する必要があります。
信頼性の高いローディング制御に代わる解決策は、ブロットからの総タンパク質測定を使用することです。一部の研究者は、クーマシー、フラミンゴピンク、シプロルビー、アミドブラック、ポンソーS、および汚れのない技術などの総タンパク質汚れでブロットを染色し、各レーンの総タンパク質シグナルをローディングコントロール16,20,13,27,1,4,12として測定しています。総タンパク質ローディング制御は、ハウスキーピングタンパク質に関連する落とし穴を回避します。まず、各サンプルに対してロードされるタンパク質の量を真に反映したものである。第2に、全タンパク質染色は、ウェスタンブロット分析のための共通のローディング範囲(複雑な細胞ライセートの10〜50μgタンパク質)において優れた線形ダイナミックレンジを示し、サンプル12間の負荷差を正確に区別する。
染色フリー技術は、アクリルアミドゲル溶液にユニークな化合物を混合し、キャストされたゲルに均等に分布する新規の全タンパク質染色法です。電気泳動が完了した後、ゲルは最低1分間UV光にさらされ、染色化合物がタンパク質中のトリプトファン残基と反応するようになる。タンパク質はUV光下で興奮し、ChemiDoc MPシステムのような染色を含まないイメージャーで視覚化および定量することができる強力な蛍光シグナルを与えます。しかし、染色を含まない化合物自体はUV光を吸収せず、ゲル画像の背景が低くなる。トリプトファン残基の修飾は不可逆的であり、タンパク質はゲルだけでなく、タンパク質の転写後いつでもブロット上で視覚化することができます。
この染色を含まない技術は、V3 Western ワークフロー (図 1)に適用され、従来のワークフローに関する主な不満、特にローディング コントロールとしてのハウスキーピングタンパク質の使用に関する懸念事項に対処します。このワークフローを使用すると、1)約20〜30分でゲルを実行し、2)ゲルラン後5分でサンプルの完全性とタンパク質分離品質をチェックすることができます。3)3-10分でタンパク質を移動します。4)転送効率を定量的に確認してください。そして5)最も重要なことは、総タンパク質負荷制御を使用して、目的のタンパク質のレベルの変化を検証する。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>567-8093 </td>
 <td>Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-4157 </td>
 <td>Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clarity Western ECL Substrate, 500 ml </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-5061</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Criterion Cell </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>165-6100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trans-Blot Turbo Transfer Starter System </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-4155</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChemiDoc MP System </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-8280</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

v3 stain-free workflow for a practical, convenient, and reliable total protein loading control in western blotting

ウェスタンブロットは非常に有用で広く採用されているラボ技術ですが、その実行は困難です。実験者は、それがいくつかのステップの最後まで正常に実行されたかどうかを知らないので、ワークフローはしばしば「ブラックボックス」として特徴付けられます。さらに、ウェスタンブロットのデータの品質は、ウェスタンブロッティングプロセス全体で効果的な品質管理ツールが不足しているため、時には挑戦されます。ここでは、従来のウェスタンブロットプロトコルに関連する主要な懸念事項に対処するために、汚れのない技術を適用するV3 westernワークフローについて説明します。このワークフローは研究者を可能にする:1)約20〜30分でゲルを実行する。2)ゲルの実行後5分以内にサンプル分離品質を可視化する。3)3-10分でタンパク質を移す。4)転送効率を定量的に検証する。そして最も重要な5)総タンパク質負荷制御を使用して関心のあるタンパク質のレベルの変化を検証する。この新しいアプローチは、βアクチン、βチューブリン、GAPDHなどのハウスキーピングタンパク質のブロットを除去して再探査する必要 を排除しますV3 染色フリーワークフローは、ウェスタンブロットプロセスをより速く、透明、より定量的で信頼性の高いものにします。

1. 染色を含まないゲル画像を用いたサンプルの完全性、タンパク質分離品質、および転写効率の評価。
HeLa細胞からのタンパク質抽出物を、18ウェル基準AnyKD TGX染色フリーゲルで20分間300Vで分離した。タンパク質サンプルは、4つの異なる量(レーン1-3、40 μg)で3倍にロードされました。レーン 4-6, 30 μg;レーン7-9、20 μg;レーン10-12、10 μg)。このゲルを1分間UV光下で活性化した 図2A は、タンパク質分離直後に取得したゲル画像を示す。タンパク質サンプルの完全性(例えば 分解)および分離品質(例えば タンパク質沈殿)は、このゲル画像で視覚的に評価することができる。その後、トランスブロットターボを用いてニトロセルロース膜に7分間タンパク質を移した。 図2B は転写後ゲルの染色を含まない画像を示す。両方の画像は、同じ露光時間(6.8秒)で取得されました。レーン3および12は、転写効率を測定するために選択した。イメージ ラボ ソフトウェアのボリューム ツールを使用して、両方のゲル イメージのレーン 3 と 12 をカバーするために長方形のボックス (青) を描きました。これらのボックスからの体積値に基づく計算は、両方の車線の転送効率が80%であることを示した(図2C)。この実験では、中小の標的タンパク質を研究するためにAnyKD TGXゲルを選択し、大きなタンパク質の転写に最適化されませんでした。転写効率を最適化するには、より低いパーセントゲル(例えば 4-20%)の使用が必要です大きなタンパク質の転写を容易にする転送時間の調整および/または調整。2.染色フリーの全タンパク質ローディングコントロールは、対象タンパク質のレベルの小さな変化を定量化するために、ウェスタンブロッティングにおけるハウスキーピングローディングコントロールに代わる信頼性の高い代替手段です。
MCM-7は、照射処理後のリンパ芽球細胞株(LCL)で20〜50%減少するレベルのDNAライセンス複製因子である。この実験では、4つの対照および照射処理されたリンパ芽球細胞株(LCL)培養液のライセート(それぞれ30μg)を、12ウェル基準AnyKD TGX染色フリーゲルで分離した。このゲルをUV光下で1分間活性化し、トランスブロットターボでPVDF膜に移して免疫ブロッティングを行った。ハウスキーピングタンパク質GAPDH(緑色)をウサギ抗体(米国細胞シグナリング技術、1:2,500)とダイライト549コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体(ロックランド、米国、1:20,000)でプローブしました。目的のMCM-7(赤)のタンパク質をマウス抗体(米国、1:1000)およびダイライト649共役ヤギ抗マウス抗体(ロックランド、1:10,000)を用いてプローブした。
図3A は、LCLサンプルの4つの制御および照射処理で検出された総タンパク質(青色)、MCM-7(赤)およびGAPDH(緑色)の多重蛍光像を示す。 図3B は、各試料(30μg)における全タンパク質パターンを示す同じブロットの染色を含まない画像である。画像ラボソフトウェアは、各レーンのMCM-7、GAPDH、および総タンパク質量を測定するためにサンプルレーン(青いボックス)を選択しました。MCM-7レベルを、染色を含まない全タンパク質測定またはGAPDHに対して正規化した。正規化されたMCM-7タンパク質レベルを統計的に分析し、MCM-7タンパク質バンドの平均容量と標準偏差(n=4)をチャートに示した(図3C)。両方の正規化方法は、小さな減少を明らかにしました (約 25%)照射処理後のMCM-7タンパク質レベルで。総タンパク質正規化を有するデータは、負荷制御としてGAPDHを用いたデータよりも標準偏差が小さくなった。
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1.jpg"> 図 1.V3ウェスタンワークフロー。 V3 ワークフローは、4 つの手順の左側の列に示されています。ワークフローで使用される主要な計測器と試薬は、各ステップで示されています。各ステップの推定時間も含まれます。右の列は、V3 ワークフローで最低 4 つのイメージを生成できることを示しています。各データの使用について説明します。前転写ゲル、転写後ゲル、およびブロット(A、B、C)の染色を含まない画像は、従来のウェスタンブロッティング技術では容易に生成できません。これらの画像とデータは、科学者のコントロールとウェスタンブロットワークフローの再現性を向上させるための手順に沿った重要な情報とチェックポイントを提供します。この標的タンパク質シグナルは、検出にHRP結合二次抗体を適用した場合は化学発光ブロット画像(D)、または蛍光ブロット画像(E)に多重化蛍光性ウェスタンブロット法を実施し、同じブロット上で同時に複数の標的タンパク質を検出した場合に、いずれも捕捉することができる。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2.jpg"> 図 2.V3 Western ワークフローの前移送ゲルおよび転写後ゲルの染色を含まない画像で、サンプルの完全性、分離品質、および転送効率を評価します。(A)事前転写ゲル染色フリー画像。(B)転写後ゲル染色不要画像。(C)タンパク質の移動効率測定。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3.jpg"> 図 3.対象タンパク質のレベルを正常化するための負荷制御として、GAPDH免疫検出との染色を含まない全タンパク質測定を比較する。(A)蛍光ウェスタンブロット画像。(B)汚れのないブロット画像。(C) 正規化 MCM-7 タンパク質レベル.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a>

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V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

V3ワークフローは、染色フリーゲルを使用したウェスタンブロット手順です。この染色フリー技術により、研究者はタンパク質分離の質を可視化し、転写効率を検証し、最も重要なのは、信頼性の高いローディングコントロールとしてタンパク質の総定量を使用して目的のタンパク質の変化を検証することが可能です。

ウェスタンブロッティングにおける実用的で便利で信頼性の高い全タンパク質ローディング制御のためのV3染色不要のワークフロー

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

v3-stain-free-workflow-for-practical-convenient-reliable-total

Research

JoVE Journal

Biology

22.4K ビュー.  Bio-Rad Laboratories. V3ワークフローは、染色フリーゲルを使用したウェスタンブロット手順です。この染色フリー技術により、研究者はタンパク質分離の質を可視化し、転写効率を検証し、最も重要なのは、信頼性の高いローディングコントロールとしてタンパク質の総定量を使用して目的のタンパク質の変化を検証することが可能です。

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Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

西洋は、Invitrogen NuPage NOVEXビストリスミニゲルを用いたウェスタンブロット

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

生物学

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to elaborate distinct aspects of motor function and to determine even subtle loss of movement capacity. To enhance efficacy and resolution of testing, tests should permit qualitative and quantitative measures of motor function and be sensitive to changes in performance during recovery periods. The present study describes a new task to assess skilled walking in the rat to measure both forelimb and hindlimb function at the same time. Animals are required to walk along a horizontal ladder on which the spacing of the rungs is variable and is periodically changed. Changes in rung spacing prevent animals from learning the absolute and relative location of the rungs and so minimize the ability of the animals to compensate for impairments through learning. In addition, changing the spacing between the rungs allows the test to be used repeatedly in long-term studies. Methods are described for both quantitative and qualitative description of both fore- and hindlimb performance, including limb placing, stepping, co-ordination. Furthermore, use of compensatory strategies is indicated by missteps or compensatory steps in response to another limb&#x2019;s misplacement. 

The ladder rung walking task is a new test to assess skilled walking and measure both forelimb and hindlimb placing, stepping, and inter-limb co-ordination.

タスクを歩くラダーラング：スコアリングシステムとその実用化。

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

ウェスタンブロッティング：サンプル調製を検出する

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

定量的なフィットネスの分析ワークフロー

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and behavioural research. As a vertebrate, zebrafish share considerable genetic sequence similarity with humans and are being used as an animal model for various human disease conditions. The advantages of zebrafish in comparison to other common vertebrate models include high fecundity, low maintenance cost, transparent embryos, and rapid development. Due to the spur of interest in zebrafish research, the need to establish and maintain a productive zebrafish housing facility is also increasing. Although literature is available for the maintenance of a zebrafish laboratory, a concise video protocol is lacking. This video illustrates the protocol for regular housing, feeding, breeding and raising of zebrafish larvae. This process will help researchers to understand the natural behaviour and optimal conditions of zebrafish husbandry and hence troubleshoot experimental issues that originate from the fish husbandry conditions. This protocol will be of immense help to researchers planning to establish a zebrafish laboratory, and also to graduate students who are intending to use zebrafish as an animal model.

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

This protocol outlines regular maintenance and care to maintain optimal conditions for zebrafish husbandry. The video illustrates the protocol for system maintenance, regular housing, feeding, breeding, and raising of zebrafish larvae.

ゼブラフィッシュの定期的ケアとメンテナンス（<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;）研究所：はじめに

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

血漿タンパク保存用採血キットからゲノムDNAを抽出するために実用的で新手法

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

Nonexpertsための系統学の実用ガイド

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

町の西部最速：クラシックウェスタンブロット分析に現代風にアレンジ

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

生物発光共鳴エネルギー転移を用いて生細胞中のタンパク質 - タンパク質相互作用を調査する

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...