タンパク質合成は誤りが起こりやすい。しかし、エラーは生理的ストレス下で適応可能である可能性があります。以前、抗酸菌の特定の翻訳誤差が抗生物質耐性に寄与していることを示しました。
特定のエラー率を測定できることで、この細菌適応機構を標的にすることができます。これらの技術の主な利点は、機能の得るレポーターが質量分析で検出することが容易ではない小さな誤差率を測定する際に絶妙に敏感であり得る。Nluc/GFPアッセイは、細菌の過剰な取り扱いやリシスを避けるため、中スループットスクリーニングを可能にします。
この手順のデモンストレーションは、博士課程の学生であるYue-Meng Chenです。今日は、このビデオを通じて、これら2人の記者を使用する手順を示します。まず、野生型と変異したマイコバクテリアレポーター株で7H9培地の2ミリリットルを接種する。
摂氏37度で1~2日間、または600ナノメートルのODが静止段階に達するまで振ります。アリコートを希釈して、0.5~1の約600ナノメートルでODを得る。その後、ATCを1ミリリットル当たり50ナノグラムの最終濃度に加えます。
直ちに、誤訳率に対する影響を測定するために、原稿に従って異なる量のksgを文化に加える。4〜6時間揺れで摂氏37度でインキュベートします。次に、細菌培養物を2ミリリットルチューブに移す。
そして、3で遠心分離機は、細菌をペレットダウンするために5分間室温で220回g。遠心分離工程後、上清を捨て、1x受動リシスバッファーの40マイクロリットルを添加して細菌を破壊する。再懸濁した細菌のライゼートを白い96ウェルプレート(サンプルあたり1つのウェル)に移し、室温で20分間振ります。
各井戸にホタル基板80マイクロリットルを加えます。15秒間振って、ルミノメーターで発光を測定します。次に、各ウェルにレニラ基板80マイクロリットルを加えます。
15秒間振って、ルミノメーターで発光を測定します。修正した値を使用して、各条件の誤訳率を計算します。まず、細菌レポーター株で7H9培地の2ミリリットルを接種する。
摂氏37度で1~2日間、または600ナノメートルのODが静止段階に達するまで振ります。次いで、7H9培地の50ミリリットルでサブ培養し、600ナノメートルでODが遅い定常相に達するまで成長する。細菌を96ウェルプレートにアリクォートする前に、1ミリリットル当たり50ナノグラムの最終濃度でATCを加え、よく混ぜます。
透明なラウンドボトム96ウェルプレートに井戸あたり100マイクロリットルを加えます。次に、選択したウェルに異なる用量のksgを追加して、誤訳率への影響をスクリーニングします。プレートのエッジウェルに200マイクロリットルの無菌水を加えて、サンプルウェルからの蒸発を制限します。
プレートを密封し、振り、摂氏37度で16~20時間誘導します。各ウェルから80マイクロリットルを取るためにマルチチャンネルピペットを使用してください。サンプルを黒底の96ウェルプレートに移し、光度計でGFP信号を測定します。
GFP信号を測定した後、プレートを3、220回gで10分間遠心する。次いで、上清の50マイクロリットルを白底の96ウェルプレートに移す。次いで、各ウェルに50マイクロリットルのNluc基板を加えます。
よく混ぜて、ルミノメーターで発光を測定します。最後に、補正したNluc発光値をGFP蛍光で割ってNluc/GFP比を決定します。本研究では、野生型の春化菌の存在下で、またksgAが削除されたS.Smegmatis株の中で、レニラホタルレポーターシステムを用いて誤訳率を測定した。
結果は、ksgA欠失株中のksg減少誤訳率の明確な用量依存的な方法を示し、ksgは、あまり強力ではなく、誤訳率のベースラインは、カスガマイシンによる変調に対する抵抗のために高かった。誤訳に対する春生シンの作用も、Nluc/GFPレポーターを用いて測定した。レニラホタルとNluc / GFPレポーターの両方がルシファーゼ活性を測定する必要があります。
小さなピペットエラーは、読み出しに大きな変動を引き起こす可能性があります。まず、信頼性の低い読み出しが発生する可能性を最小限に抑えるために、各反復の数を増やすことをお勧めします。
