このプロトコルの意義は、DICや暗視野のような他の技術よりも簡単で安価な高いフレームレートで高コントラスト画像を取得することができるラベルフリーイメージング技術を導入することです。この手法の主な利点は、実装が簡単で、使いやすい点です。それは安価で、蛍光顕微鏡と容易に組み合わせることができる。
この方法は、個々の微小管を視覚化するために開発されました。これは、大きなタンパク質複合体やナノ粒子を可視化するために使用される可能性を有する。主な難しさは、半分銀色のミラーを追加するためにフィルターキューブをいじくり回すために必要な活性化エネルギーです。
初めてテクニックを試している人への私のアドバイスは、それを行うだけです。まず、適切なフィルターキューブを使用して、蛍光顕微鏡のフィルターホイールに50/50ミラーを挿入します。ミラーは、反射防止コーディングを頻繁に行う場合と同様に注意して処理します。
また、高い数値開口を持っている高倍率の目的に回します。ここに示されているのは、1.3の数値絞りを持つ100x油の目的です。次に、プラスチックパラフィンフィルムの3ミリメートル幅のストリップをカットするために直線エッジとしてカミソリの刃と顕微鏡スライドを使用してください。
プラスチックパラフィンフィルムストリップの2つを3ミリメートル離してきれいな22×22ミリメートルのカバースリップに置き、ストリップの上に18×18ミリメートルのカバースリップを置いてチャンネルを形成します。パラフィンフィルムが密閉されたチャネルを形成するために、カバースリップを摂氏100度から30秒間ヒートブロックに移します。ピペットを使用して、灌流により抗ローダミン抗体の1ミリリットル当たり50マイクログラムで流れ、スライドを10分間インキュベートする。
インキュベーションに続いて、濾過されたBRB80を使用してチャネルを5回洗浄し、次いで濾過されたBRB80で1%ポロクサマー407で流れ、表面を非特異的結合に対して遮断し、スライドを10分間インキュベートする。再度、ろ過されたBRB80を使用してチャネルを5回洗浄します。サンプルが乾燥するのを防ぐには、フィルターしたBRB80の2つの液滴をチャネルの端に追加し、必要に応じてバッファを追加します。
サンプルを顕微鏡ステージに置き、エピイルミネーション光源をオンにします。パラフィンフィルムエッジに焦点を合わせ、サンプル表面を見つけ、その後、チャンバーの中心にビューを設定するためにフィールドを移動します。光路内の光からの光の背面反射により、目的が上下に移動すると、複数のサーフェスが観察されます。
次に、フィールドダイヤフラムを中央に配置し、中間に閉じ、調整ネジを使用します。ダイヤフラムが正しく整列されたら、再度開きます。次に、ベルトランレンズをスライドさせて、目的の出口瞳孔としても知られる背面焦点面を表示します。
出口瞳孔の端を越えて開口振動板を閉じ、調整ネジを使用して、出口瞳孔に対して絞りダイヤフラムを中央に配置します。開口振動板を開き、その端を出口の瞳孔の端と一致させることで、再確認します。次に、絞り板を目的の開口数の約3分の2に設定します。
開始するには、カメラの露出時間を 10 ミリ秒に設定し、カメラのダイナミック レンジをほぼ飽和するように照明を調整します。次に、ピペットを使用して、0.22マイクロメートルの濾過BRB80で10マイクロリットルのGMPCPP安定化微小管を流動させる。表面のイメージング上の微小管結合を監視します。
10~20個の微小管が視野内に結合したら、濾過されたBRB80でサンプルを2回洗浄します。10 ミリ秒の露光時間と 1 秒の遅延時間を合計 10 秒間設定して、マイクロチューブの 10 画像を取得します。次に、遅延なく100枚の画像を取得しながら、チャネルの長軸に沿ってステージコントローラを使用してステージを移動して、背景画像を取得します。
脳管管を使用して微小管のダイナミクスを画像化するには、サンプルヒーター温度を摂氏37度に設定して開始します。ピペットを使用して、10マイクロリットルのGMPCPP安定化微小管種子を流れ、表面を生画像化して表面に結合してそれらを監視する。10~20種が視野内に結合されたら、あらかじめ温め、ろ過されたBRB80のチャネル体積の2倍を使用してサンプルを洗浄します。
次に、10マイクロリットルの重合ミックスで流れる。微小管の成長を測定するには、取得ソフトウェアを使用してタイムラプスを設定し、5秒ごとに15分間画像を取得します。各時点で10の平均画像を取得することによりコントラストを高めます。
前のセクションに示すように、背景イメージを取得します。画像に移動し、スタックを選択し、Zプロジェクト、中央値を選択して中央値を計算します。処理に行き、画像計算機に移動し、ドロップダウンメニューから減算を選択して、対応する背景を差し引きます。
32 ビット浮動小数点結果オプションがオンになっていることを確認します。微小管収縮の場合は、時間遅延をゼロに設定し、露光時間を10ミリ秒に保つことで、100フレーム/秒で画像を取得します。干渉誘導顕微鏡でハイコントラスト画像を取得する重要な要因は、照明の数値開口を適切に設定することです。
これは、絞り振動板サイズによって制御される目的の出口瞳孔での照明ビームのサイズを導くことによって行うことができる。フローレスで標識された安定化微小管のサンプルを使用して、顕微鏡の焦点ノブを使用してマイクロチューブを蛍光イメージングしながら焦点を合わせます。カメラの露出を 10 ミリ秒に設定し、絞りダイヤフラムを最小の開口部に閉じます。
また、照明を調整して、カメラのダイナミックレンジをほぼ飽和するか、最大に達するまで調整します。10個以上の微小管を含む視野をストリーミングして10枚の画像を取得します。次に、背景画像を取得します。
ダイヤフラムのサイズを変更し、以前に決定された照明強度に合わせて照明強度を調整します。10の新しい画像と新しい背景を取得します。ダイヤフラムの全範囲が完了するまで、このプロセスを繰り返します。
取得した各視野について、対応する背景を減算し、前に示したように、結果として得られる背景の減算画像を平均化します。次に、各開口部サイズの微小管のバックグラウンドノイズ比に対する平均信号を計算する。ダイヤフラムのサイズを、バックグラウンドノイズ比と信号の最大を生成するサイズに設定します。
ここに示すように、同等のコントラストを生み出すサイズの範囲がある可能性があります。よく整列した顕微鏡では、微小管は背景の減算なしで見えるべきである。ただし、背景を減算すると、微小管のコントラストが向上します。
さらにコントラストを高めるために、平均化、4aフィルタリング、または両者の組み合わせを用いることができる。ここに示すラインスキャンは、画像品質の段階的な改善を説明します。これらは、各処理ステップでのバックグラウンドノイズの顕著な低減を記述します。
微小管のダイナミクスは、時間経過映画から生成されるキノグラフで報告することができます。ここでは、フレームレート0.2フレームで取得したキノグラフの例を示します。破線は種を示します。
この手順を実行する場合、高い数値絞り目標を使用することが重要です。また、絞り径フレームのサイズを正しく調整して設定することも重要です。IRMと蛍光イメージングを組み合わせることで、例えば微小管結合タンパク質や微小管ダイナミクスの改質方法を研究しやすくなる。
この技術は、写真の損傷を大幅に低減し、高いフレームレートの取得を可能にし、高い時間分解能と良好な追跡精度で長期間にわたって微小管などの標識された生体高分子を研究しやすくします。
