이 프로토콜의 중요성은 DIC 및 다크 필드와 같은 다른 기술보다 간단하고 저렴한 높은 프레임 속도로 고대비 이미지를 습득할 수 있는 라벨없는 이미징 기술을 도입한다는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 구현하기 쉽고 사용하기 쉽다는 것입니다. 그것은 저렴 하 고 그것은 쉽게 형광 현미경과 결합 될 수 있습니다.
이 방법은 개별 마이크로투블러를 시각화하기 위해 개발되었습니다. 그것은 큰 단백질 복합체 및 나노 입자를 시각화하는 데 사용될 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 가장 큰 어려움은 필터 큐브를 사용하여 반 은 거울을 추가하는 데 필요한 활성화 에너지입니다.
처음으로 기술을 시도하는 사람에게 내 조언은 그냥 그것을 하는 것입니다. 시작하려면 적절한 필터 큐브를 사용하여 형광 현미경의 필터 휠에 50/50 미러를 삽입합니다. 거울을 자주 조심스럽게 처리하면 반사 방지 코딩이 있습니다.
숫자 조리개가 높은 높은 배율 목표를 설정합니다. 여기에 표시된 것은 1.3의 수치 조리개와 100배 의 석유 목표입니다. 다음으로 면도날과 현미경 슬라이드를 직선 가장자리로 사용하여 플라스틱 파라핀 필름의 3mm 너비 스트립을 자른다.
플라스틱 파라핀 필름 스트립 2개를 깨끗한 22x 22mm 커버 슬립에 3밀리미터 간격으로 놓은 다음 스트립 위에 18x 18mm 커버 슬립을 놓으면 채널을 형성합니다. 파라핀 필름이 밀봉된 채널을 형성하기 위해 덮개 를 섭씨 100도에서 100도에서 30초 동안 열 블록으로 옮기습니다. 파이펫을 사용하여, 관류에 의해 항 로다민 항체의 밀리리터 당 50 마이크로 그램으로 흐르고 10 분 동안 슬라이드를 배양하십시오.
인큐베이션에 따라 여과된 BRB80을 사용하여 채널을 5회 세척한 다음 필터링된 BRB80에서 1%폴로사머 407로 흐어 표면을 비특이적 결합에 대해 차단하고 슬라이드를 10분 동안 배양합니다. 다시, 필터링 된 BRB80을 사용하여 채널을 다섯 번 세척. 샘플이 건조되지 않도록 채널 끝에 필터링된 BRB80의 두 방울을 추가하고 필요에 따라 버퍼를 더 추가합니다.
현미경 단계에 샘플을 놓고 에피 조명 광원을 켭니다. 파라핀 필름 가장자리에 초점을 맞추어 샘플 표면을 찾은 다음 필드를 이동하여 챔버의 중앙으로 뷰를 설정합니다. 광학 경로 내의 광학에서 빛의 반사로 인해 목표가 위아래로 이동함에 따라 여러 표면을 관찰합니다.
다음으로, 필드 다이어프램을 중간에 닫고 조정 나사를 사용하여 시야에서 중심을 이시합니다. 다이어프램이 제대로 정렬되면 다시 엽니다. 그런 다음 버트 랜드 렌즈에서 슬라이드하여 목표의 출구 동공이라고도하는 등 초점 평면을 봅니다.
출구 동공의 가장자리를 넘어 조리개 다이어프램을 닫고 조정 나사를 사용하여 출구 동공과 관련하여 조리개 다이어프램을 중심으로 합니다. 조리개 다이어프램을 열고 가장자리를 출구 동공의 가장자리와 일치시켜 다시 확인하십시오. 그런 다음 조리개 다이어프램을 목표의 수치 조리개 중 약 3분의 2로 설정합니다.
먼저 카메라의 노출 시간을 10밀리초로 설정하고 조명을 조정하여 카메라 동적 범위를 거의 포화시합니다. 다음으로, 0.22 마이크로미터 여과 BRB80에서 GMPCPP 안정화 마이크로투알의 10 마이크로리터에서 파이펫을 사용합니다. 표면의 이미징에 대한 현미경 결합을 모니터링합니다.
10 내지 20 마이크로터블러가 시야 내에 바인딩되면 필터링 된 BRB80으로 샘플을 두 번 세척하십시오. 10밀리초 노출과 1초 지연 기간을 총 10초 동안 설정하여 10개의 마이크로튜브 이미지를 획득합니다. 그런 다음 채널의 긴 축을 따라 스테이지 컨트롤러를 사용하여 스테이지를 이동하여 100개의 이미지를 지연 없이 획득하여 배경 이미지를 습득합니다.
뇌 튜룰린을 사용하여 미세 수염 역학을 이미지하려면 샘플 히터 온도를 섭씨 37도로 설정하여 시작합니다. 파이펫을 사용하여 GMPCPP 안정화 된 마이크로 투벌 씨앗의 10 마이크로 리터에서 유동하고 표면을 라이브로 이미징하여 표면에 결합하는 것을 모니터링하십시오. 10~20개의 씨앗이 시야 내에 바인딩되면 미리 데워지고 필터링된 BRB80의 채널 부피의 두 배를 사용하여 샘플을 세척합니다.
다음으로, 중합 혼합물의 10 마이크로리터로 플로우한다. 마이크로튜블러 성장을 측정하려면 획득 소프트웨어를 사용하여 시간 경과를 설정하여 15분 동안 5초마다 이미지를 획득합니다. 매 시점에서 평균 10의 이미지를 획득하여 대비를 향상시킵니다.
이전 섹션에 표시된 대로 배경 이미지를 수집합니다. 이미지로 이동하여 스택을 선택한 다음 Z 프로젝트, 중앙값을 사용하여 중앙값을 계산합니다. 처리하고, 이미지 계산기로 이동하며, 드롭다운 메뉴에서 빼기를 선택하여 해당 배경을 뺍니다.
32비트 플로트 결과 옵션을 선택했는지 확인합니다. 마이크로튜블러 수축의 경우 시간 지연을 0으로 설정하고 노출 시간을 10밀리초로 유지하여 초당 100프레임의 이미지를 획득합니다. 간섭 유도 현미경 검사법과 높은 대비 이미지를 획득하기위한 중요한 요소는 조명의 수치 조리개를 올바르게 설정하는 것입니다.
이는 조리개 다이어프램 크기에 의해 제어되는 목표의 출구 동공에서 조명 빔의 크기를 안내하여 수행할 수 있습니다. 플로레스센트 표지된 안정화 된 마이크로 투비의 샘플을 사용하여 현미경의 초점 손잡이를 사용하여 현미경의 집중 노브를 사용하여 마이크로 튜블러를 집중시키면서 형광적으로 이미징하십시오. 카메라 노출을 10밀리초로 설정하고 조리개 다이어프램을 가장 작은 개구부로 닫습니다.
또한 조명을 조정하여 카메라의 동적 범위를 거의 포화하거나 최대값에 도달할 때까지 조정할 수 있습니다. 10개 이상의 마이크로튜브를 포함하는 시야를 스트리밍하여 10개의 이미지를 수집합니다. 그런 다음 배경 이미지를 얻습니다.
다이어프램의 크기를 변경하고 이전에 결정된 것과 일치하도록 조명 강도를 조정합니다. 10개의 새로운 이미지와 새로운 배경을 확보합니다. 다이어프램의 전체 범위가 완료될 때까지 이 프로세스를 반복합니다.
획득한 모든 시야에 대해 해당 배경을 빼고 결과 배경이 이전에 표시된 이미지를 평균값으로 지정합니다. 그런 다음, 모든 개구부 크기에 대해 마이크로튜블의 배경 잡음 비율에 대한 평균 신호를 계산합니다. 다이어프램 크기를 배경 잡음 비율에 가장 높은 신호를 생성하는 크기로 설정합니다.
여기에 표시된 것과 같이 유사한 대비를 생성하는 다양한 크기가 있을 수 있습니다. 잘 정렬 된 현미경으로, 현미경은 배경 뺄림없이 볼 수 있어야합니다. 그러나 배경을 빼면 미세 수염의 대비가 향상됩니다.
대비를 더욱 향상시키기 위해 평균화, 4a 필터링 또는 둘 다의 조합을 사용할 수 있습니다. 여기에 표시된 선 스캔은 이미지 품질의 점진적 개선을 설명합니다. 이는 각 처리 단계에서 배경 잡음이 눈에 띄게 감소하는 것을 설명합니다.
마이크로투불 역학은 시간 경과 영화에서 생성되는 키노그래프에서 보고될 수 있습니다. 초당 0.2 프레임의 프레임 속도로 획득한 키노그래프가 여기에 나와 있습니다. 파선선은 씨앗을 표시합니다.
이 절차를 수행할 때는 높은 숫자 조리개 목표를 사용하여 작업하는 것이 중요합니다. 조리개 직경 프레임의 크기를 올바르게 정렬하고 설정하는 것도 중요합니다. IRM과 형광 이미징을 결합하여 연구하기 쉽습니다(예: 마이크로투룰 결합 단백질 및 미세투막 역학 을 수정하는 방법) 등이 있습니다.
이 기술은 사진 손상을 상당히 줄이고 더 높은 프레임 속도를 얻을 수 있으므로 높은 시간 적 해상도와 좋은 추적 정밀도로 장기간 마이크로 튜버와 같은 표지 된 생체 폴리머를 쉽게 연구 할 수 있습니다.
