La importancia de este protocolo es que introduce una técnica de imagen sin etiquetas capaz de adquirir imágenes de alto contraste a altas velocidades de fotogramas que es más simple y más barata que otras técnicas como DIC y campo oscuro. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de implementar y es fácil de usar. Es barato y se puede combinar con microscopios de fluorescencia fácilmente.
El método fue desarrollado para visualizar microtúbulos individuales. Tiene el potencial de ser utilizado para visualizar grandes complejos proteicos y nanopartículas. La principal dificultad es la energía de activación necesaria para jugar con el cubo de filtro para añadir el espejo de media plata.
Mi consejo a alguien que está probando la técnica por primera vez es simplemente hacerlo. Para empezar, inserte un espejo 50/50 en la rueda de filtro de un microscopio fluorescente utilizando un cubo de filtro adecuado. Manipule el espejo con cuidado, ya que a menudo tienen una codificación antirreflejo.
Gire a un objetivo de gran magnificación que también tiene una alta apertura numérica. El que se muestra aquí es un objetivo de aceite 100x con una apertura numérica de 1.3. A continuación, utilice una cuchilla de afeitar y un portaobjetos de microscopio como borde recto para cortar tiras de tres milímetros de ancho de película de parafina de plástico.
Coloque dos de las tiras de película de parafina de plástico de tres milímetros de separación en un resbalón de cubierta limpio de 22 por 22 milímetros, luego coloque un resbalón de cubierta de 18 por 18 milímetros en la parte superior de las tiras para formar un canal. Transfiera el resbalón de la cubierta a un bloque de calor a 100 grados centígrados durante 10 a 30 segundos para que la película de parafina forme un canal sellado. Con una pipeta, fluya en 50 microgramos por mililitro de un anticuerpo anti-rhodamina por perfusión e incubar el portaobjetos durante 10 minutos.
Después de la incubación, lave el canal cinco veces usando BRB80 filtrado, luego fluya en 1%Poloxamer 407 en el BRB80 filtrado para bloquear la superficie contra la unión no específica e incubar el portaobjetos durante 10 minutos. Una vez más, lave el canal cinco veces utilizando BRB80 filtrado. Para evitar que la muestra se seque, agregue dos gotas del BRB80 filtrado en los extremos del canal y agregue más búfer según sea necesario.
Coloque la muestra en la etapa del microscopio y encienda la fuente de luz de epiiluminación. Concéntrese en el borde de la película de parafina para encontrar la superficie de la muestra y, a continuación, mueva el campo para establecer la vista en el centro de la cámara. Observará varias superficies a medida que el objetivo se mueve hacia arriba y hacia abajo debido a la reflexión posterior de la luz de la óptica dentro de la trayectoria óptica.
A continuación, centra el diafragma de campo en el campo de visión cerrándolo hasta la mitad y usando los tornillos de ajuste. Una vez que el diafragma esté correctamente alineado, vuelva a abrirlo. A continuación, deslice en la lente Bertrand para ver el plano focal posterior, también conocido como el pupilo de salida del objetivo.
Cierre el diafragma de apertura más allá de los bordes de la pupila de salida y utilice los tornillos de ajuste para centrar el diafragma de apertura con respecto a la pupila de salida. Compruebe dos veces abriendo el diafragma de apertura y combinando sus bordes con los de la pupila de salida. A continuación, establezca el diafragma de apertura en aproximadamente dos tercios de la apertura numérica del objetivo.
Para comenzar, ajuste el tiempo de exposición de la cámara a 10 milisegundos y ajuste la iluminación para que casi satura el rango dinámico de la cámara. A continuación, utilice una pipeta para fluir en 10 microlitros de microtúbulos estabilizados con GMPCPP en 0,22 micrómetros filtrados BRB80. Supervise la unión de microtúbulos en la toma de imágenes de la superficie.
Una vez que se atado de 10 a 20 microtúbulos dentro del campo de visión, lave la muestra dos veces con el BRB80 filtrado. Adquiera 10 imágenes de los microtúbulos configurando un lapso de tiempo con una exposición de 10 milisegundos y un segundo de retardo para un total de 10 segundos. A continuación, adquiera imágenes de fondo moviendo el escenario utilizando el controlador de escenario a lo largo del eje largo del canal mientras adquiere 100 imágenes sin demora.
Para tomar imágenes de la dinámica de los microtúbulos utilizando la tubulina cerebral, comience por ajustar la temperatura del calentador de muestra a 37 grados centígrados. Con una pipeta, fluya en 10 microlitros de semillas de microtúbulos estabilizadas por GMPCPP y monitoríelos uniéndose a la superficie mediante imágenes de la superficie en vivo. Una vez que se atado de 10 a 20 semillas dentro del campo de visión, lave la muestra utilizando el doble del volumen del canal de BRB80 precalegado y filtrado.
A continuación, fluya en 10 microlitros de la mezcla de polimerización. Para medir el crecimiento de los microtúbulos, configure un lapso de tiempo utilizando el software de adquisición para adquirir una imagen cada cinco segundos durante 15 minutos. Mejore el contraste adquiriendo una imagen promediada de 10 en cada punto de tiempo.
Adquiera imágenes de fondo como se muestra en la sección anterior. Calcule la mediana yendo a la imagen, seleccionando stack, luego el proyecto Z y, a continuación, mediana. Restar el fondo correspondiente yendo a procesar, yendo a la calculadora de imágenes, y eligiendo restar del menú desplegable.
Asegúrese de que la opción de resultado flotante de 32 bits esté marcada. Para la contracción de microtúbulos, adquiera imágenes a 100 fotogramas por segundo ajustando el retardo de tiempo a cero y manteniendo el tiempo de exposición en 10 milisegundos. Un factor importante para adquirir imágenes de alto contraste con la microscopía de inducción de interferencia es ajustar correctamente la apertura numérica de la iluminación.
Esto se puede hacer guiando el tamaño del haz de iluminación en la pupila de salida del objetivo, que es controlado por el tamaño del diafragma de apertura. Usando una muestra de microtúbulos estabilizados con etiqueta florescente, ponga los microtúbulos en foco usando la perilla de enfoque del microscopio mientras los toma imágenes fluorescentes. Establezca la exposición de la cámara en 10 milisegundos y cierre el diafragma de apertura a su abertura más pequeña.
Además, ajuste la iluminación para casi saturar el rango dinámico de la cámara o hasta que se alcance el máximo. Adquiera 10 imágenes transmitiendo un campo de visión que contenga 10 o más microtúbulos. A continuación, adquiera una imagen de fondo.
Cambie el tamaño del diafragma y ajuste la intensidad de la iluminación para que coincida con la que se determinó anteriormente. Adquiere 10 nuevas imágenes y un nuevo fondo. Repita este proceso hasta que se complete todo el rango del diafragma.
Para cada campo de visión adquirido, reste el fondo correspondiente y promediar el fondo resultante restado imágenes como se muestra anteriormente. A continuación, calcule la relación señal media a ruido de fondo de los microtúbulos para cada tamaño de apertura. Ajuste el tamaño del diafragma a la que produce la relación señal-ruido de fondo más alta.
Es posible que haya una gama de tamaños que produzcan un contraste comparable como se muestra aquí. Con un microscopio bien alineado, los microtúbulos deben ser visibles sin resta de fondo. La restación del fondo, sin embargo, mejora el contraste del microtúbulo.
Para mejorar aún más el contraste, se puede utilizar un promedio, un filtrado de 4a o una combinación de ambos. Los escaneos de línea que se muestran aquí describen la mejora incremental de la calidad de la imagen. Estos describen una reducción notable del ruido de fondo con cada paso de procesamiento.
La dinámica de los microtúbulos se puede notificar en los quirógrafos, que se generan a partir de películas de lapso de tiempo. Aquí se muestra un metógrafo de ejemplo adquirido a una velocidad de fotogramas de 0,2 fotogramas por segundo. Las líneas discontinuas marcan las semillas.
Al realizar este procedimiento, es importante trabajar con objetivos de apertura numérica alta. También es importante alinear y establecer el tamaño del marco del diámetro de la abertura correctamente. Es fácil combinar IRM con imágenes de fluorescencia para estudiar, por ejemplo, proteínas de unión a microtúbulos y cómo modifican la dinámica de microtúbulos.
La técnica reduce considerablemente el daño fotográfico y permite una mayor adquisición de la velocidad de fotogramas, lo que facilita el estudio de biopolímeros etiquetados como microtúbulos durante largos períodos de tiempo con alta resolución temporal y buena precisión de seguimiento.
