Значение этого протокола заключается в том, что он вводит без этикетки метод визуализации, способный приобретать изображения с высоким контрастом при высоких частотах кадров, что проще и дешевле, чем другие методы, такие как DIC и темное поле. Основным преимуществом этой техники является то, что она проста в реализации и проста в использовании. Это недорого, и это может быть объединено с флуоресцентных микроскопов легко.
Метод разработан для визуализации отдельных микротрубочек. Он имеет потенциал для визуализации крупных белковых комплексов и наночастиц. Основная трудность заключается в энергии активации, необходимой, чтобы возиться с кубом фильтра, чтобы добавить половину серебряного зеркала.
Мой совет тому, кто пытается технику в первый раз просто сделать это. Для начала вставьте зеркало 50/50 в колесо фильтра флуоресцентного микроскопа с помощью соответствующего кубика фильтра. Ручка зеркало с осторожностью, как часто они имеют анти-отражения кодирования.
Поверните к высокой цели увеличения, которая также имеет высокую численную диафрагму. Показанная здесь 100-х нефтяная цель с численной диафрагмой 1,3. Далее используйте лезвие бритвы и слайд микроскопа в качестве прямого края, чтобы вырезать три миллиметра в ширину полосы пластиковой парафиновой пленки.
Поместите два пластиковых парафиновой пленки полосы три миллиметра друг от друга на чистой 22 на 22 миллиметров крышку скольжения, а затем место 18 на 18 миллиметров крышка скольжения на верхней части полосы, чтобы сформировать канал. Перенесите крышку скольжения в тепловой блок при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 10 до 30 секунд для парафиновой пленки, чтобы сформировать запечатанный канал. Используя пипетку, поток в 50 микрограммов на миллилитр анти-родамин антитела перфузии и инкубировать слайд в течение 10 минут.
После инкубации, мыть канал пять раз с помощью фильтрованных BRB80, а затем поток в 1%Poloxamer 407 в фильтруемой BRB80, чтобы заблокировать поверхность от неспецифических связывания и инкубировать слайд в течение 10 минут. Опять же, мыть канал пять раз с помощью фильтрованных BRB80. Чтобы предотвратить высыхание образца, добавьте две капли отфильтрованного BRB80 на концах канала и добавьте больше буфера по мере необходимости.
Поместите образец на сцену микроскопа и включите источник эпи-освещения. Сосредоточьтесь на краю парафиновой пленки, чтобы найти поверхность образца, а затем переместить поле, чтобы установить вид на центр камеры. Вы будете наблюдать несколько поверхностей, как цель перемещается вверх и вниз из-за обратного отражения света от оптики в оптическом пути.
Далее центр поля диафрагмы в поле зрения, закрыв его на полпути и с помощью регулировки винты. После того, как диафрагма правильно выровнены, вновь открыть его. Затем сдвиньте в объектив Бертрана, чтобы просмотреть заднюю фокусную плоскость, также известную как ученик выхода цели.
Закройте диафрагму диафрагмы за краями выхода зрачка и используйте винты регулировки для того чтобы центр диафрагмы диафрагмы по отношению к зрачку выхода. Двойная проверка, открыв диафрагму диафрагмы и сопоставляя ее края с краями выхода зрачка. Затем установите диафрагму диафрагмы примерно на две трети численной диафрагмы цели.
Для начала установите время экспозиции камеры до 10 миллисекунд и отрегулируйте освещение, чтобы почти насытить динамический диапазон камеры. Далее используйте пипетку для потока в 10 микролитров стабилизированных микротрубочек GMPCPP в 0,22 микрометра отфильтрованного BRB80. Мониторинг связывания микротрубочек на изображении поверхности.
После того, как от 10 до 20 микротрубочек связаны в поле зрения, мыть образец дважды с фильтруемой BRB80. Приобрети 10 изображений микротрубочек, установив промежуток времени с 10 миллисекундной экспозицией и один второй период задержки в общей сложности на 10 секунд. Затем приобрети фоновые изображения, перемещая сцену с помощью сценического контроллера вдоль длинной оси канала, приобретая 100 изображений без задержек.
Для изображения динамики микротрубочек с помощью трубулина мозга начните с установки температуры нагревателя до 37 градусов по Цельсию. Используя пипетку, поток в 10 микролитров GMPCPP стабилизированных семян микротрубочек и контролировать их связывания с поверхностью путем изображения поверхности жить. После того, как от 10 до 20 семян связаны в поле зрения, мыть образец, используя в два раза объем канала предварительно разогретых и фильтрованных BRB80.
Далее, поток в 10 микролитров полимеризации смеси. Для измерения роста микротрубочек найте промежуток времени, используя программное обеспечение для приобретения, чтобы получить изображение каждые пять секунд в течение 15 минут. Увеличь контраст, приобретая усредное изображение 10 в каждой точке времени.
Приобретайте фоновые изображения, как показано в предыдущем разделе. Рассчитайте медиану, переехав на изображение, выбрав стек, затем проект, затем медиану. Вычесть соответствующий фон, переходя к обработке, собирается изображение калькулятор, и выбор вычитать из меню высадки.
Убедитесь, что 32-битный вариант результата поплавка проверяется. Для усадки микротрубочек приобретайте изображения со 100 кадров в секунду, устанавливая задержку времени до нуля и сохраняя время экспозиции на уровне 10 миллисекунд. Важным фактором для получения высококонтрастных изображений с помощью микроскопии индукции помех является правильное настройка численного отверстия освещения.
Это можно сделать, направляя размер луча освещения на выходе зрачка цели, который контролируется размером диафрагмы. Используя образец флуоресцентно помеченных стабилизированных микротрубочек, принесите микротрубоконы в фокус с помощью фокусировки ручки микроскопа в то время как флуоресцентно изображения их. Установите экспозицию камеры до 10 миллисекунд и закройте диафрагму диафрагмы до ее малейшего открытия.
Кроме того, отрегулируйте освещение, чтобы почти насытить динамический диапазон камеры или до тех пор, пока не будет достигнут максимум. Приобрети 10 изображений, потоковое поле зрения, содержащее 10 или более микротрубочек. Затем приобрети фоновое изображение.
Измените размер диафрагмы и отрегулируйте интенсивность освещения, чтобы соответствовать тем, что было определено ранее. Приобрети 10 новых изображений и новый фон. Повторите этот процесс до тех пор, пока весь диапазон диафрагмы не будет завершен.
Для каждого приобретенного поля зрения вычесть соответствующий фон и усредить полученные фоновые вычитаемые изображения, как показано ранее. Затем вычислите среднее отношение сигнала к фоновому шуму микротрубочек для каждого размера отверстия. Установите размер диафрагмы на тот, который производит самый высокий коэффициент шума сигнала к фону.
Вполне возможно, что существует целый ряд размеров, которые производят сопоставимый контраст, как показано здесь. С хорошо выровненным микроскопом, микротрубоконы должны быть видны без фонового вычитания. Вычитание фона, однако, повышает контраст микротрубокон.
Для дальнейшего повышения контрастности можно использовать фильтрацию в среднем, фильтрацию 4a или их комбинацию. Показанные здесь сканы линии описывают постепенное улучшение качества изображения. Они описывают заметное снижение фонового шума с каждым этапом обработки.
Динамика микротрубочек может быть зарегистрирована в кинографах, которые генерируются из фильмов с промежуток времени. Здесь показан пример кинографа, приобретенного со скоростью кадра 0,2 кадра в секунду. Разбитые линии отмечают семена.
При выполнении этой процедуры важно работать с высокими целями численной диафрагмы. Также важно правильно выровнять и установить размер каркаса диаметра диафрагмы. Легко сочетать IRM с флуоресцентной визуализацией для изучения, например, микробубульных связывающих белков и того, как они изменяют динамику микротрубочек.
Техника значительно снижает урон от фотографий и позволяет получить более высокую частоту кадров, что облегчает изучение помеченных биополимов, таких как микротрубочные устройства в течение длительных периодов времени с высоким временным разрешением и хорошей точностью отслеживания.
