O significado deste protocolo é que ele introduz uma técnica de imagem livre de rótulos capaz de adquirir imagens de alto contraste a altas taxas de quadros que é mais simples e barata do que outras técnicas como DIC e dark field. A principal vantagem dessa técnica é que é fácil de implementar e é fácil de usar. É barato e pode ser combinado com microscópios de fluorescência facilmente.
O método foi desenvolvido para visualizar microtúbulos individuais. Tem potencial para ser usado para visualizar grandes complexos proteicos e nanopartículas. A principal dificuldade é a energia de ativação necessária para mexer com o cubo do filtro para adicionar o espelho meio prata.
Meu conselho para alguém que está tentando a técnica pela primeira vez é apenas fazê-lo. Para começar, insira um espelho 50/50 na roda do filtro de um microscópio fluorescente usando um cubo de filtro apropriado. Manuseie o espelho com cuidado, pois muitas vezes eles têm uma codificação anti-reflexão.
Recorrida a um objetivo de alta ampliação que também tem uma alta abertura numérica. O mostrado aqui é um objetivo de óleo de 100x com uma abertura numérica de 1,3. Em seguida, use uma lâmina de barbear e um slide de microscópio como uma borda reta para cortar três milímetros de tiras de largura de filme de parafina de plástico.
Coloque duas tiras de filme de parafina de plástico três milímetros separadas em um deslizamento de cobertura limpo de 22 por 22 milímetros, em seguida, coloque um deslizamento de cobertura de 18 por 18 milímetros em cima das tiras para formar um canal. Transfira o deslizamento de cobertura para um bloco de calor a 100 graus celsius por 10 a 30 segundos para que o filme de parafina forme um canal selado. Usando uma pipeta, flua em 50 microgramas por mililitro de um anticorpo anti-rhodamina por perfusão e incubar o slide por 10 minutos.
Após a incubação, lave o canal cinco vezes usando BRB80 filtrado e flua em 1%Poloxamer 407 no BRB80 filtrado para bloquear a superfície contra ligação não específica e incubar o slide por 10 minutos. Novamente, lave o canal cinco vezes usando BRB80 filtrado. Para evitar que a amostra seque, adicione duas gotículas do BRB80 filtrado nas extremidades do canal e adicione mais tampão conforme necessário.
Coloque a amostra no estágio do microscópio e ligue a fonte de luz epi-iluminação. Concentre-se na borda do filme de parafina para encontrar a superfície da amostra e, em seguida, mova o campo para definir a vista para o centro da câmara. Você observará múltiplas superfícies à medida que o objetivo é movido para cima e para baixo devido ao reflexo da luz da óptica dentro do caminho óptico.
Em seguida, centralize o diafragma de campo no campo de visão fechando-o no meio do caminho e usando os parafusos de ajuste. Uma vez que o diafragma esteja devidamente alinhado, reassum-no. Em seguida, deslize na lente Bertrand para ver o plano focal traseiro, também conhecido como o pupilo de saída do objetivo.
Feche o diafragma de abertura além das bordas da pupila de saída e use os parafusos de ajuste para centralizar o diafragma de abertura em relação à pupila de saída. Verifique duas vezes abrindo o diafragma de abertura e combinando suas bordas com as da pupila de saída. Em seguida, defina o diafragma de abertura para cerca de dois terços da abertura numérica do objetivo.
Para começar, ajuste o tempo de exposição da câmera para 10 milissegundos e ajuste a iluminação para quase saturar o alcance dinâmico da câmera. Em seguida, use uma pipeta para fluir em 10 microlitres de microtúbulos estabilizados GMPCPP em 0,22 micrômetros filtrados BRB80. Monitore a ligação do microtúbulo na imagem da superfície.
Uma vez que 10 a 20 microtúbulos estejam ligados no campo de visão, lave a amostra duas vezes com o BRB80 filtrado. Adquira 10 imagens dos microtúbulos configurando um lapso de tempo com uma exposição de 10 milissegundos e um período de atraso de um segundo por um total de 10 segundos. Em seguida, adquira imagens de fundo movendo o palco usando o controlador de palco ao longo do eixo longo do canal, ao mesmo tempo em que adquire 100 imagens sem demora.
Para a dinâmica dos microtúbulos de imagem usando tubulina cerebral, comece definindo a temperatura do aquecedor amostral para 37 graus celsius. Usando uma pipeta, flua em 10 microliters de sementes de microtúbulas estabilizadas pelo GMPCPP e monitore-as ligando-as à superfície por meio de imagens ao vivo da superfície. Uma vez que 10 a 20 sementes estejam vinculadas no campo de visão, lave a amostra usando o dobro do volume do canal de BRB80 pré-aquecido e filtrado.
Em seguida, flua em 10 microliters da mistura de polimerização. Para medir o crescimento dos microtúbulos, configure um lapso de tempo usando o software de aquisição para adquirir uma imagem a cada cinco segundos por 15 minutos. Melhore o contraste adquirindo uma imagem média de 10 em cada ponto de tempo.
Adquira imagens de fundo como mostrado na seção anterior. Calcule a mediana indo para a imagem, selecionando pilha, depois projeto Z, em seguida, mediana. Subtraia o fundo correspondente indo para o processo, indo para a calculadora de imagem e escolhendo subtrair do menu suspenso.
Certifique-se de que a opção de resultado de flutuação de 32 bits seja verificada. Para encolhimento de microtúbulos, adquira imagens a 100 quadros por segundo, definindo o atraso de tempo para zero e mantendo o tempo de exposição em 10 milissegundos. Um fator importante para a aquisição de imagens de alto contraste com a microscopia de indução de interferência é definir adequadamente a abertura numérica da iluminação.
Isso pode ser feito guiando o tamanho do feixe de iluminação na pupila de saída do objetivo, que é controlada pelo tamanho do diafragma de abertura. Usando uma amostra de microtúbulos estabilizados com rótulos florescentes, leve os microtúbulos em foco usando o botão de foco do microscópio enquanto os imagens fluorescentes. Defina a exposição da câmera a 10 milissegundos e feche o diafragma de abertura à sua menor abertura.
Além disso, ajuste a iluminação para quase saturar o alcance dinâmico da câmera ou até que o máximo seja atingido. Adquira 10 imagens transmitindo um campo de visão contendo 10 ou mais microtúbulos. Em seguida, adquira uma imagem de fundo.
Altere o tamanho do diafragma e ajuste a intensidade de iluminação para corresponder ao que foi previamente determinado. Adquira 10 novas imagens e um novo plano de fundo. Repita este processo até que toda a gama do diafragma esteja concluída.
Para cada campo de visão adquirido, subtraia o fundo correspondente e média das imagens subtraídas de fundo resultantes, como mostrado anteriormente. Em seguida, calcule a relação de ruído médio do sinal para o fundo dos microtúbulos para cada tamanho de abertura. Defina o tamanho do diafragma para aquele que produz a maior relação de ruído de sinal para fundo.
É possível que haja uma gama de tamanhos que produzem contraste comparável como mostrado aqui. Com um microscópio bem alinhado, os microtúbulos devem ser visíveis sem subtração de fundo. Subtrair o fundo, no entanto, melhora o contraste do microtúbulo.
Para melhorar ainda mais o contraste, a média, a filtragem de 4a ou uma combinação de ambos podem ser usadas. As varreduras de linha mostradas aqui descrevem a melhoria incremental da qualidade da imagem. Estes descrevem uma redução notável do ruído de fundo a cada etapa de processamento.
A dinâmica dos microtúbulos pode ser relatada em cineógrafos, que são gerados a partir de filmes de lapso de tempo. Um exemplo de cineógrafo adquirido a uma taxa de quadros de 0,2 quadros por segundo é mostrado aqui. As linhas tracejadas marcam as sementes.
Ao realizar este procedimento, é importante trabalhar com objetivos de abertura numérica elevada. Também é importante alinhar e definir corretamente o tamanho do quadro de diâmetro de abertura. É fácil combinar IRM com imagens de fluorescência para estudar, por exemplo, proteínas de ligação de microtúbulos e como modificam a dinâmica dos microtúbulos.
A técnica reduz consideravelmente o dano fotográfico e permite maior aquisição de taxas de quadros, facilitando o estudo de biopolímeros rotulados, como microtúbulos por longos períodos de tempo com alta resolução temporal e boa precisão de rastreamento.
