Il significato di questo protocollo è che introduce una tecnica di imaging senza etichette in grado di acquisire immagini ad alto contrasto ad alte velocità di fotogrammi che è più semplice ed economica di altre tecniche come DIC e campo scuro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile da implementare ed è facile da usare. È economico e può essere combinato facilmente con microscopi a fluorescenza.
Il metodo è stato sviluppato per visualizzare i singoli microtubuli. Ha il potenziale per essere utilizzato per visualizzare grandi complessi proteici e nanoparticelle. La difficoltà principale è l'energia di attivazione necessaria per armeggiare con il cubo filtrante per aggiungere il mezzo specchio d'argento.
Il mio consiglio a qualcuno che sta provando la tecnica per la prima volta è solo farlo. Per iniziare, inserire uno specchio 50/50 nella ruota filtrante di un microscopio fluorescente utilizzando un cubo filtrante appropriato. Maneggiare lo specchio con cura tutte le volte che hanno una codifica anti-riflessione.
Passare a un obiettivo ad alto ingrandimento che ha anche un'apertura numerica elevata. Quello mostrato qui è un obiettivo di olio 100x con un'apertura numerica di 1,3. Successivamente, utilizzare una lama di rasoio e uno scivolo al microscopio come bordo dritto per tagliare tre strisce larghe tre millimetri di pellicola di paraffina di plastica.
Posizionare due strisce di pellicola di paraffina di plastica a tre millimetri di distanza su uno scivolo di copertura pulito di 22 per 22 millimetri, quindi posizionare uno scivolo di copertura di 18 per 18 millimetri sopra le strisce per formare un canale. Trasferire il coperchio in un blocco di calore a 100 gradi celsius per 10-30 secondi affinché la pellicola di paraffina formi un canale sigillato. Utilizzando una pipetta, scorrere in 50 microgrammi per millilitro di un anticorpo anti-rodiammina per perfusione e incubare lo scivolo per 10 minuti.
Dopo l'incubazione, lavare il canale cinque volte utilizzando BRB80 filtrato, quindi scorrere in 1%Poloxamer 407 nel BRB80 filtrato per bloccare la superficie contro attacchi non specifici e incubare il vetrino per 10 minuti. Ancora una volta, lavare il canale cinque volte utilizzando BRB80 filtrato. Per evitare che il campione si asciughi, aggiungere due goccioline del BRB80 filtrato alle estremità del canale e aggiungere più buffer in base alle esigenze.
Posizionare il campione sullo stadio del microscopio e accendere la sorgente luminosa dell'epi-illuminazione. Concentrati sullo spigolo della pellicola di paraffina per trovare la superficie del campione, quindi sposta il campo per impostare la vista al centro della camera. Osserverai più superfici mentre l'obiettivo viene spostato su e giù a causa del riflesso posteriore della luce dall'ottica all'interno del percorso ottico.
Quindi, centrare il diaframma del campo nel campo visivo chiudendolo a metà strada e utilizzando le viti di regolazione. Una volta allineato correttamente il diaframma, riaprarlo. Quindi, fai scorrere l'obiettivo Bertrand per vedere il piano focale posteriore, noto anche come pupilla di uscita dell'obiettivo.
Chiudere il diaframma di apertura oltre i bordi della pupilla di uscita e utilizzare le viti di regolazione per centrare il diaframma di apertura rispetto alla pupilla di uscita. Ricontrolla aprendo il diaframma di apertura e abbinando i suoi bordi a quelli della pupilla di uscita. Quindi, impostare il diaframma di apertura su circa due terzi dell'apertura numerica dell'obiettivo.
Per iniziare, impostare il tempo di esposizione della fotocamera su 10 millisecondi e regolare l'illuminazione per saturare quasi l'intervallo dinamico della fotocamera. Successivamente, utilizzare una pipetta per fluire in 10 microlitri di microtubuli stabilizzati gmpcpp in BRB80 filtrato da 0,22 micrometri. Monitorare il legame del microtubulo sull'imaging della superficie.
Una volta che da 10 a 20 microtubuli sono legati all'interno del campo visivo, lavare il campione due volte con il BRB80 filtrato. Acquisire 10 immagini dei microtubuli impostando un time lapse con un'esposizione di 10 millisecondi e un periodo di ritardo di un secondo per un totale di 10 secondi. Quindi, acquisisci immagini di sfondo spostando il palco utilizzando il controller di scena lungo l'asse lungo del canale acquisendo 100 immagini senza ritardi.
Per immaginire la dinamica dei microtubuli usando la tubulina cerebrale, inizia impostando la temperatura del riscaldatore del campione a 37 gradi celsius. Utilizzando una pipetta, flusso in 10 microlitri di semi di microtubuli stabilizzati GMPCPP e monitorarli legandoli alla superficie imaging della superficie viva. Una volta che 10-20 semi sono legati all'interno del campo visivo, lavare il campione utilizzando il doppio del volume del canale di BRB80 preri warmed e filtrato.
Successivamente, flusso in 10 microlitri del mix di polimerizzazione. Per misurare la crescita dei microtubuli, impostare un time lapse utilizzando il software di acquisizione per acquisire un'immagine ogni cinque secondi per 15 minuti. Migliora il contrasto acquisendo un'immagine media di 10 in ogni punto di tempo.
Acquisire immagini di sfondo come illustrato nella sezione precedente. Calcola la mediana andando all'immagine, selezionando stack, quindi progetto Z, quindi mediana. Sottrarre lo sfondo corrispondente andando a elaborare, andando al calcolatore di immagini e scegliendo sottrai dal menu a discesa.
Verificare che l'opzione del risultato float a 32 bit sia selezionata. Per il restringimento dei microtubuli, acquisire immagini a 100 fotogrammi al secondo impostando il ritardo su zero e mantenendo il tempo di esposizione a 10 millisecondi. Un fattore importante per acquisire immagini ad alto contrasto con la microscopia a induzione di interferenza è quello di impostare correttamente l'apertura numerica dell'illuminazione.
Questo può essere fatto guidando la dimensione del fascio di illuminazione alla pupilla di uscita dell'obiettivo, che è controllato dalla dimensione del diaframma di apertura. Utilizzando un campione di microtubuli stabilizzati con etichetta fluorescente, mettere a fuoco i microtubuli usando la manopola di messa a fuoco del microscopio mentre li immagini fluorescentmente. Impostare l'esposizione della fotocamera a 10 millisecondi e chiudere il diaframma di apertura alla più piccola apertura.
Inoltre, regolare l'illuminazione per saturare quasi l'intervallo dinamico della fotocamera o fino al massimo. Acquisisci 10 immagini trasmettendo in streaming un campo visivo contenente 10 o più microtubuli. Quindi acquisire un'immagine di sfondo.
Modificare le dimensioni del diaframma e regolare l'intensità dell'illuminazione in base a quella precedentemente determinata. Acquisisci 10 nuove immagini e un nuovo sfondo. Ripetere questo processo fino al completamento dell'intero intervallo del diaframma.
Per ogni campo visivo acquisito, sottrarre lo sfondo corrispondente e mediare le immagini sottratte in background risultanti come mostrato in precedenza. Quindi, calcola il rapporto medio segnale/rumore di fondo dei microtubuli per ogni dimensione di apertura. Impostare la dimensione del diaframma su quella che produce il rapporto segnale/rumore di fondo più elevato.
È possibile che vi sia una gamma di dimensioni che producono un contrasto comparabile come mostrato qui. Con un microscopio ben allineato, i microtubuli dovrebbero essere visibili senza sottrazione di sfondo. Sottrarre lo sfondo, tuttavia, migliora il contrasto del microtubulo.
Per migliorare ulteriormente il contrasto, è possibile utilizzare una media, un filtraggio 4a o una combinazione di entrambi. Le scansioni di linea mostrate qui descrivono il miglioramento incrementale della qualità dell'immagine. Questi descrivono una notevole riduzione del rumore di fondo ad ogni fase di elaborazione.
La dinamica dei microtubuli può essere riportata nei chiografi, che vengono generati da film time lapse. Qui viene mostrata una cinegrafia di esempio acquisita a una frequenza fotogrammi di 0,2 fotogrammi al secondo. Le linee tratteggiate segnano i semi.
Quando si esegue questa procedura, è importante lavorare con obiettivi ad alta apertura numerica. È anche importante allineare e impostare correttamente le dimensioni del telaio del diametro dell'apertura. È facile combinare IRM con imaging a fluorescenza per studiare, ad esempio, le proteine leganti i microtubuli e come modificano la dinamica dei microtubuli.
La tecnica riduce notevolmente i danni fotografici e consente un'acquisizione più elevata della frequenza dei fotogrammi, rendendo più facile lo studio di biopolimeri etichettati come i microtubuli per lunghi periodi di tempo con alta risoluzione temporale e una buona precisione di tracciamento.
