当社のプロトコルは、レンズの発達と生理学の機能研究の出発点であり、ゼブラフィッシュにおけるレンズフェノタイプの逆遺伝子スクリーニングの出発点となります。当社のプロトコルは、ゼブラフィッシュレンズ膜形態のインビトロおよびインビボ分析を橋渡しし、ゼブラフィッシュレンズ光学の開発を定量化するための新しい簡単な方法を提供します。ゼブラフィッシュのレンズの形態や光学を分析することで、レンズの発達、正常な生理学、病態生理学を制御するメカニズムに関する洞察が得られます。
これらの洞察は、白内障を遅らせたり予防したりする能力につながる可能性があります。非対称的に局在したレンズ核のゼブラフィッシュ以外の種では報告されていない。レンズ縫合糸を識別することは、核の局在を測定するためにレンズを正しく向ける上で重要です。
トリケーヌで十分な沈離を確認した後、マイクロ解剖ハサミを使用して、大人または幼虫のゼブラフィッシュから両方の目をすぐに切り取り、両方の目をPBSで満たされたシリコーン解剖型を備えた35ミリメートルのカスタムメイドのペトリ皿に入れます。成虫のゼブラフィッシュからレンズを収穫するには、眼の後部を上に置き、光学ディスクを通して45度未満の角度で鉗子を挿入します。解剖はさみを使用して、視神経板から固定眼の毛様体領域までの筋と皮を通して2つまたは3つの放射状切開を行い、花びらのようにレチナとスクレラを剥がします。
目を反転させ、角膜側を上にして、スクレアと角膜の操作を通じて、スクレラと角膜の操作を通じて間接的にレンズを固定するために、眼の平らな側を使用して、眼と付属組織を引き離し、レンズから余分な組織を慎重にトリミングします。幼虫ゼブラフィッシュレンズの収穫のために、PBSのシリコーン皿の平らな部分に幼虫の目の後部側を置き、鋭利なタングステン針を使用して、別の針または鉗子で目を固定しながら、離筋と強膜を通して放射状の切り傷を行い、その後、解離された目からレンズを穏やかにすくう。前後軸軸レンズの核の局在を測定するには、35ミリメートル皿のPBSで新しく切り出したレンズを、焦点面に平行に向いたポールと縫合線を持つカバーガラス底を持つ35ミリメートル皿で軸方向に向けます。
レンズ核を特定するには、通常、レンズ皮質とレンズ核の界面で発生する屈折率の違いを探します。レンズ縫合が明らかでない場合、レンズカプセルに鉗子を持つわずかななめは縫合糸とレンズ核を明らかにし、測定のためにレンズの向きを助ける。カメラを搭載した解剖顕微鏡のステージに皿を置き、レンズ核を用いてレンズを焦点を合わせ、明視野照明の下、または差動干渉コントラスト光学で画像化します。
キャリブレーション用に同じ倍率でマイクロメーターを画像化し、[ライブビュー]をクリックします。[スナップショット] をクリックしてイメージを取得し、TIFF ファイルとして保存します。取得したレンズ画像を校正するには、適切な画像処理ソフトウェアプログラムで、直線ツールを選択し、マイクロメータ画像に既知の長さの線を描きます。
[分析とスケールの設定]をクリックし、既知の距離と単位を入力してから、[グローバルキャリブレーション]を選択して[OK]をクリックします。レンズ核の中心から前極までの距離を測定するには、レンズ縫合線の位置を特定し、直線ツールを使用して、レンズ核の画像中心を軸方向に沿って線を引きます。この線の中心はレンズ核の中心です。この点からレンズの前極に別の線を引き、解析メニューの[測定]を選択して距離を計測します。
前極から後極に別の線を引き、この距離をレンズ直径として測定し、結果ウィンドウからスプレッドシートにこれらの長さをコピーし、レンズ半径に対するレンズ核の正規化された局在を計算します。受精後3日までに、前極に前縫合糸が形成され、細胞の顕著な収束は、固定胚の狭い繊維細胞膜のファロイジン染色によって明確に視覚化される。レンズ膜に局在するmAppleトランスジェニックにおけるより強力な広繊維細胞標識は、膜サブドメインの生可視化を可能にするが、縫合収束を欠いている。
後縫合糸は、受精後3日間でインビトロとインビボの両方を視覚化することができる。赤道面では、ファロイジンは外皮質繊維細胞に強くラベルを付け、平坦な六角形の形状を明らかにする。ファロイジンは、圧縮されたレンズ核と野生型および変異型レンズから除外され、区別がつかないように見える。
レンズ膜に局在するmAppleモザイクトランスジェニックにおける広い繊維細胞の強力な標識は、変異レンズ内の細胞体積の破壊を明らかにする。トランスジーン発現は透過性によって制限されないので、モザイクによってはレンズ核標識が明らかになる。野生型動物では、レンズ核は成人期に集中する前に発達の初期段階で前レンズポールに近づき始める。
細胞膜が赤色に蛍光を発するトランスジェニック宿主における緑色タグタンパク質の発現により、同時にタンパク質の局在化が可能となり、生体内での繊維細胞形態の評価も可能となる。ゼブラフィッシュは、インビボ研究に特に適しています。ここで説明するツールを使用して、生体内システムで主にインビトロで研究されたレンズ機構をプローブすることができます。
