ミニスコープの生体内カルシウムイメージングは、自由に行動する動物の深部脳構造における何百ものニューロンからの空間的および時間的に協調した活性を研究者が調べることを可能にします。ミニスコープのインビボカルシウムイメージングは、細胞型特異的、大規模、および縦方向の記録を実行する能力を含む多くの利点を提供する。ウイルス注射およびGRINレンズ移植のための当社の手術プロトコルは、インビボカルシウムイメージング用の深部脳用の市販またはカスタムビルドの単一光子および2つの光子イメージングシステムと互換性があります。
手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるRashmi Thapaです。麻酔をかけられたマウスの剃毛された手術領域を消毒した後、メスを使用して正中線に沿って皮膚を通して2センチメートルの切開を行い、頭蓋骨のラムダおよびブレグマを露出させる。0.5ミリメートルの歯科用ドリルバリをブレグマから1.94ミリメートル前後部および内側側方0.5ミリメートルの位置に位置決めした後、頭蓋骨の穴あけを開始する。
次に、マイクロポンプのコントロールパネルを使用してウイルスをマイクロリットルシリンジにロードし、500ナノリットルの気泡を引き出し、続いて毎秒50ナノリットルの流量で800ナノリットルのウイルスを抜き取る。針をゆっくりと脳組織に下ろし、背側腹側1.75ミリメートルのターゲットZ座標まで移動させ、次に背側腹側1.65ミリメートルのZ座標までわずかに上方に動かす。コントロールパネルで、マイクロポンプを毎分50ナノリットルの流量で500ナノリットルのウイルスを注入するように設定してから、[実行]ボタンを押してウイルスを注入します。
注射が終わったら、皮膚の端を整列させ、4-0の縫合糸で切開部を慎重に閉じます。感染を防ぐために縫合された領域に抗生物質軟膏を塗布する。グラデーションインデックスまたはGRINレンズを移植するには、細かいはさみを使用して、目の間の前側からラムダの後ろの後側までの高さ1.5センチメートル、1.5センチメートルの基部の皮膚の三角形の領域を切り取ります。
頭蓋骨を完全に洗浄して乾燥させた後、シアノアクリレートを皮膚の端に塗布し、皮膚を頭蓋骨に付着させる。シアノアクリレートが乾燥した5分後、直径1.2ミリメートルの歯科用ドリルバリを、ブレグマから内側側方0.8ミリメートルの前後1.94ミリメートルの位置に位置付ける。頭蓋骨をドリルスルーし、続いて30ゲージの針先を使用して硬膜を除去します。
45度の角度の鋭い鉗子ですべての骨破片をきれいにします。次に、27ゲージの手動研磨鈍い端の針を針ホルダーに取り付け、10度の角度で傾けたロボットアームに結合させ、針ホルダーのもう一方の端を家の真空システムに接続します。ブレグマのZ座標をゼロに設定するためにブレグマボタンをクリックする前に、ブレグマに触れたばかりの針の先端を見つけます。
入力X値を0.8、入力Y値を1.94、入力Z値を1.0に設定し、[検索]ボタンをクリックして、頭蓋骨のドリル穴の上部に針を移動します。針の先端をドリルで開けた穴の中央に配置し、Z 位置 0 まで下げます。真空をオンにし、先端が曲がった30ゲージの針に接続された重力制御チューブシステムを介して、人工脳脊髄液(ACSF)で露出した脳領域をすすぎ始めます。
ACSFは、0.2ミクロンのフィルターでろ過されながら、95%の酸素と5%の二酸化炭素の混合ガスで連続的にバブリングされます。AutoStereotaソフトウェアを使用して、脳組織の吸引は4ラウンドで完了します。吸引の最初のラウンドでは、Z 値がゼロであることを確認します。
次に、zStep セッションで、1 行目と 2 行目をクリックして確認します。最初の行の値を 0.2 と 1 に設定します。2 行目の値を 0.15 と 4 に設定します。
モードセッションで、針のサイズを27ゲージと1.2に設定します。ディムを 0.9 に設定します。他のすべての値はデフォルトになります。
吸引を開始するには、NotSet、KeepZero、およびStartボタンを順番にクリックします。吸引の最初のラウンドは、深さ0.8ミリメートル、直径1ミリメートルのカラムポケットを生成します。吸引の 3 回目のラウンドで、zStep セッションの最初の行をクリックして確認し、最初の行の値を 1.8 と 1 に設定します。
モードセッションで、針のサイズを27ゲージと2.2に設定します。他の値を前のラウンドと同じにして、願望を開始します。3回目の吸引の後、カラムポケットの深さは1.8ミリメートルです。
最後の吸引は、ポケットの底に溜まった血液をきれいにすることです。吸引を開始する前に、zStep セッションで最初の行の値を 1.6 と 1 に設定し、モードセッションで針のサイズを 27 ゲージ、2.2 とディム 0.6 に設定します。ポケットに血液がなくなったら、真空を止め、ACSFの灌漑を停止し、針をZ座標で2ミリメートル、中央から0.5ミリメートル前方に持ち上げます。
滅菌した1ミリメートルGRINレンズを脳組織ポケットに入れます。次に、ヘラの助けを借りて、GRINレンズと脳組織との間の隙間に融解したアガロースを塗布する。アガロースがゲルを形成した後、マイクロブレードを用いて余分なアガロースを除去する。
歯科用セメント粉末と触媒液を予め冷やした混合でよく混合し、GRINレンズを囲むことから始めて、露出した頭蓋骨全体を覆うことによって、頭蓋骨上に自己硬化型接着性樹脂セメントの層を塗布する。きれいなプラスチック井戸で、歯科用セメント粉末と黒炭を液体と混合して、歯科用セメントの第1層の上に混合物の薄層を塗布する。5分間固めます。
ミニスコープをケーブルに接続し、カスタム開発ソフトウェアNuViewをオンにします。NuViewで、[ハードウェア]をクリックし、LED1をチェックし、[ストリーム]ボタンをクリックしてライブ画像を表示します。ライブストリーミングを停止するには、[停止]ボタンをクリックします。
次に、ミニスコープをカスタムメイドのミニスコープ保持アームに固定します。電動コントローラの助けを借りて、露出したGRINレンズのすぐ上にミニスコープを配置し、レンズの表面に平行にします。ミニスコープをゆっくりとGRINレンズの方向に下ろし、最適な焦点面が見つかるまでZ位置を調整します。
ミニスコープの位置を変えずに、ミニスコープベースの周りに歯科用セメントの最初の層を塗布します。セメントが固まったら、ミニスコープがマウスヘッドの上に自立できるように、保持アームを慎重に取り外します。すべてのギャップを埋めるために、ベースの周りに歯科用セメントの第2層を塗布し、ギャップからLED光漏れがないことを確認します。
歯科用セメントを硬化させます。イソフルランでマウスを短時間麻酔した後、保護キャップを取り外す前に小さなドライバーでベースのロックネジを緩め、アセトンを浸した綿棒でGRINレンズの表面を拭きます。ミニスコープをケーブルに接続し、NuViewソフトウェアを起動して、鈍い鉗子の助けを借りてわずかに締め付けたり緩めたりして、ベースに対するミニスコープの位置を調整して、最適な焦点面の識別を開始します。
最適な焦点面が決まったら、ロックネジを締めてからケーブルを外し、マウスをホームケージに戻します。ビヘイビアカメラソフトウェアをオンにして、ライブストリーム機能でマウスビヘイビアアリーナを表示します。トップカメラのフォーカスを手動で調整します。
[ストロボのトリガー]を選択し、トリガーの有効/無効を確認してから、[録音]ボタンをクリックします。次に、[参照] を使用して、行動記録を保存する場所を選択します。目的の画像形式を選択します。
マウスをアリーナに近づけ、ミニスコープをデータ集録システムにリンクされているケーブルに接続します。次に、アリーナの中央にマウスを置きます。ビヘイビアカメラソフトウェアで、[録画の開始]をクリックします。
NuViewで、LED1をチェックし、[キャプチャ]をクリックしてから、トリガーボタンをクリックして録音を開始します。これにより、カルシウムイメージングとマウス行動の同時記録が可能になります。ヒット 停止 3, 000フレーム後に ファイルを保存します.
記録が完了したら、マウスをイソフルランで簡単に麻酔し、ミニスコープをベースから取り外し、保護キャップをベースの上に置き、マウスをホームケージに戻します。最適でないin vivoカルシウムイメージングからの細胞マップには、いくつかの活性ニューロンが含まれていましたが、成功したイメージングからの細胞マップには、焦点領域に数百の活性ニューロンが含まれていました。インビボカルシウムイメージングに失敗した典型的な例では、領域が暗く、5つ未満の活性ニューロンを含むことが観察されたか、または領域が明るく、活性ニューロンがなかった。
代表的な解析では、連続したインビボカルシウムイメージング記録からの最大投影蛍光細胞マップおよびカルシウム過渡現象が示されている。実験マウスの内側PFCにおけるGCaMP6f発現およびGRINレンズ移植の死後評価は、GCaMP6fが発現し、GRINレンズが所望の脳領域に正確に移植されたことを示した。良好なカルシウムイメージングを得るためには、GRINレンズを移植する前に、出血が完全に停止し、フィールドに血栓がないことを確認する必要があります。
この技術は、異なるヒト脳障害のマウスモデルにおける神経回路の変化を研究し、薬物候補が変化した回路を正常化できるかどうかをテストするために利用することができる。
