私たちはKaz NagaosaとShiratsuchi Akikoに助言をしてくれたことに感謝します。

1.準備<ol><li> 新鮮なブドウジュース寒天プレートの調製 <ol><li>寒天4.4gに水100mLを加え、電子レンジで混合物を加熱して寒天を溶解する。 </li><li> 80mLの新鮮なブドウ果汁、5mLの酢酸、および5mLのエタノールを寒天溶液に加える。 </li><li>約1.5 mLの溶液をピペットで各スライドガラスに注ぎ、凝固させます。 </li></ol></li><li> 6cm皿アガロースプレートの調製 <ol><li>アガロース0.5gに水50mLを加え、電子レンジで混合物を加熱してアガロースを溶解する。 </li><li>約2.5 mLのアガロース溶液を6 cmディッシュにピペットで注ぎます。 </li></ol></li></ol>ステージ16胚コレクション<ol><li>大人のハエを収集し、200匹の雌と200匹の雄を50 mLコニカルチューブに加える。 </li><li>酵母に新鮮なブドウ果汁寒天のプレートを50 mLのチューブに入れ、スポンジcaで閉じますp。 </li><li> 2〜3日間、16℃で軽くインキュベートします。プレートを1日1回交換してください。 </li><li>ハエを25℃で1時間動かします。 </li><li>古いプレートを酵母のない新しいプレートに交換してください。飛行機に2時間卵を産むことを許可する。 </li><li>プレートを集め、16℃で26時間インキュベートする。 </li><li> 0.2％（v / v）トリトンX - 100を含むPBS 1mLにペイントブラシでプレートから胚を収集します。 </li><li> 0.2％（v / v）のトリトンX-100を含有する1mLのPBSで胚を2回洗浄する。 </li><li>絨毛膜を除去するために、1.2mLの次亜塩素酸ナトリウム溶液（2.2〜3.4％Cl）を3分間胚に加える。 </li><li> 0.2％（v / v）Triton X-100を含む1mLのPBSで胚を4回洗浄する。 </li><li> 6cmのディッシュのアガロースプレートに胚を置きます。 Roberts 20によって記載されているように、顕微鏡下で第16段階胚を採取する。マイクロピペットを備えた1.5mLのTreffマイクロ試験管に約50個の胚を収集する。 </li></ol> 3.準備胚細胞の分化<ol><li> 150μLのPBSで胚を2回洗浄する。 </li><li> PBS中の200μLのコラゲナーゼ（0.25％（w / v））の存在下で、1.5mLマイクロ試験管およびペレットミキサー中で胚を30回均質化する。 </li><li>ピペットで10回胚細胞を分散させ、細胞懸濁液を1.5mLチューブに移す。 37℃で1分間水浴中で細胞をインキュベートする。この手順を2回繰り返します。 </li><li>細胞懸濁液にPBS800μLを添加し、1400× gで4℃で5分間遠心分離する。 </li><li>上清を除去し、PBSに200μLのトリプシン（0.25％（w / v））を細胞に加える。 50回ピペッティングすることにより胚細胞を分散させる。 </li><li>細胞懸濁液を70μm細胞ストレーナーでろ過する。 </li><li>トリプシン活性を停止させるために、濾過した細胞懸濁液に熱不活性化ウシ胎仔血清40μLを添加する。 800μLのPBSを添加し、4℃で1400× gで5分間遠心分離する。 </li><li>スーパーナタを削除する沈殿した細胞を200μLのPBSに懸濁し、1400× gで4℃で5分間遠心分離する。 </li><li>上清を除去し、沈殿した細胞を30μLのPBSに懸濁する。 </li><li>調製した細胞懸濁液をアミノプロピルトリエトキシシランでコーティングしたガラススライドにマウントし、細胞がスライドガラスに付着するまで10〜15分間待つ。 </li><li>ガラススライド上の残りの溶液をピペットで除去する。固定のために10〜15分間細胞に4％（w / v）PFA（パラホルムアルデヒド）を含む60〜70μLのPBSをマウントする。 </li><li>固定溶液を除去し、ガラススライドをPBSに1分以上置きます。 </li></ol> 4.血球の染色<ol><li> 抗クロキモト抗体による免疫染色 <ol><li> 0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBS中で10分間メタノールを連続的に浸漬し、10分間PBSでスライドさせる。 </li><li> 5％（v / v）の全ブタ血清をPBS中に20μL詰めるブロッキングのために0.2％（v / v）Triton X-100を細胞に添加する。スライドを室温で20分間インキュベートする。 </li><li>ガラススライドから液を除去し、PBS、0.2％を含有する抗Croquemort抗血清19、21（0.1％（V / V））の20μLマウント（v / v）のトリトンX-100細胞上。スライドを4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>ガラススライドを0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBSに10分間5回浸漬する。 </li><li>ガラススライドをPBSに10分間浸します。 </li><li> 0.2％（v / v）Triton X-100および5％（v / v）ブタ血清を含むPBS中の20μLのアルカリホスファターゼ標識抗ラットIgG（0.5％（v / v） 1時間撹拌した。 </li><li>ガラススライドを0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBSに10分間5回浸漬する。 </li><li> 100 mM Tris-HCl、pH 9.5,100 mM NaCl、50 mM MgCl 2を含むバッファーに10分間スライドガラスを浸します。 </li><li> 0.23mg / mLの5-ブロモ-4を含有するホスファターゼ基質基質溶液（BCIP）、0.35mg / mLのニトロブルーテトラゾリウム（NBT）、100mM Tris-HCl、pH9.5,100mM NaCl、および50mM MgCl 2を細胞に添加した。 </li><li>適切な染色のために顕微鏡下で細胞を観察する。血球の顆粒中に強い紫色のシグナルが現れた場合、基質溶液を除去し、ガラススライドを10mM Tris-HCl、pH 8.5および1mM EDTAからなる緩衝液に浸す。約5〜10分間の染色が推奨される。 </li></ol></li><li> 抗GFP抗体による免疫染色（血球の染色のための別の選択肢） <ol><li>ガラススライドをメタノール中で10分間、0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBSを10分間、PBSを10分間浸漬する。 </li><li>ブロッキングのために0.2％（v / v）のTriton X-100を含有するPBSに5％（v / v）ブタ血清20μLをマウントする。スライドを室温で20分間インキュベートする。 </li><li>ガラススライド上の溶液を除去し、20μLのマウス抗GFP抗体（1％（v / v））/ PBS cをマウントする。細胞上の0.2％（v / v）Triton X-100を含む。スライドを室温で一晩インキュベートする。 </li><li>ガラススライドを0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBSに10分間5回浸漬する。 </li><li>ガラススライドをPBSに10分間浸します。 </li><li> 0.2％（v / v）トリトンX-100および5％（v / v）全ブタ血清を含有するPBS中の20μLのアルカリホスファターゼ標識抗マウスIgG（0.5％（v / v） 1時間撹拌した。 </li><li>ガラススライドを0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBSに10分間5回浸漬する。 </li><li> 100mM Tris-HCl、pH9.5,100mM NaCl、および50mM MgCl 2からなる緩衝液中に10分間ガラススライドを浸漬する。 </li><li>細胞に0.23mg / mL BCIP、0.35mg / mL NBT、100mM Tris-HCl、pH9.5,100mM NaCl、および50mM MgCl 2を含むホスファターゼ基質溶液をマウントする。 </li><li>適切な染色のために顕微鏡下で細胞を観察する。紫色のシグナルが全血球に現れると、基質溶液を除去し、10mMのトリス-HCl、pH8.5および1mMのEDTAを含む。約10〜15分間の染色が推奨される。 </li></ol></li></ol> 5.TUNELによるアポトーシス細胞の染色<ol><li>ガラススライドをPBSに5分間浸します。 </li><li>新しいPBSで繰り返します。 </li><li> 10分間、細胞上の平衡緩衝液（材料表を参照）をマウントする。 </li><li>ガラススライドから溶液を取り出し、37℃で1時間、細胞に5μLの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよび15μLのReaction Bufferを含む20μLのTdT溶液をマウントする。 </li><li>ガラススライドから溶液を除去し、スライドを0.5 mLのSTOP / Washバッファーと17 mLの水で構成されたバッファーに浸します。 </li><li>スライドを5分間3回PBSに浸す。 </li><li>抗ジゴキシゲニン - ペルオキシダーゼ20μLを室温で30分間細胞に添加する。 </li><li>ガラススライドをPBSに5分間4回浸漬する。 </li><li> 50mM Tris-HCl、pH7.5を含む30mLのペルオキシダーゼ基質溶液にガラススライドを浸します3,3&#39;-ジアミノベンジジンテトラハイドロクロライド（DAB）、0.002％（v / v）H 2 O 2の30秒間の完全マイクロスパチュラである。 </li><li>アポトーシス細胞が褐色に染色されるまで、ステップ5.9を繰り返す。ガラスを水に浸してペルオキシダーゼ反応を停止させる。 </li><li>観察のために細胞を水で囲む。 </li></ol> 6.アポトーシス細胞の食作用のレベルを測定する。 <ol><li>ファゴサイトーシスのレベルを評価するために、サンプルを光学顕微鏡下で観察する。クロークポート陽性細胞または血球としてのGFP陽性細胞、アポトーシス細胞としてのTUNEL陽性細胞、および貪食血球としての二重陽性細胞を計数する。 </li><li>貪食指数は、Croquemort陽性細胞またはGFP陽性細胞の総数に対する二重陽性細胞の数として定義される。 300以上の血球が観察されることが推奨される。 </li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

<html>本明細書では、 ショウジョウバエ胚を用いた食作用アッセイについて記載した。胚細胞を分散させて貪食量を定量的に測定することにより、血球マーカーであるCroquemortまたはsrpHemo-駆動GFPについて、血球、 ショウジョウバエプロフェッショナル貪食細胞を免疫染色し、アポトーシス細胞をこのプロトコールでTUNELによって検出する。食作用のレベルは、血球の総数お...

後生動物では、 例えば 、線虫線虫（Caenorhabditis elegans）、果実はキイロショウジョウバエ 、マウスやヒトを飛ぶ、細胞の大多数は、自分の体を形作るために開発中のアポトーシスを受けるし、成人期に恒常性1、2を維持します。アポトーシス細胞は、完全に除去されなければ免疫原性細胞内物質を放出することによって周囲の組織に炎症を誘発するため、迅速に除去する必要がある3 。食細胞の貪食受容体によって認識され、貪食3、4、5、6によって除去される迅速な除去を容易にするために、本アポトーシス細胞いわゆる食べる-MEを信号。このように、食作用は宿主恒常性の維持に重要な役割を果たし、従って、分子の解明<html>アポトーシス細胞の食作用の根底にある機構が重要である。 アポトーシス細胞の食作用に関与する機構は、線虫、ハエ、およびマウスの種間で進化的に保存されているようである7 。いくつかの食作用アッセイが、現在、これらのモデル動物におけるアポトーシス細胞の貪食を評価するために利用可能である。 線虫では 、131体細胞は発達中にプログラム細胞死を起こし、細胞死体は非専門食細胞である隣接細胞によって貪食される8 。したがって、 C.エレガンスの残りの細胞死体の数を数えることは、インビボでの食作用のレベルを示す。死細胞数の増加を示し、線虫の変異体を探索することにより、食作用のために必要ないくつかの遺伝子が同定されており、遺伝的に10、9特徴付け、S = &quot;外部参照&quot;&gt; 11、12。 初代培養食細胞、一般にマクロファージを用いたエクスビボ食作用アッセイは、しばしばマウスにおいて利用される。アポトーシス細胞は、Jurkat細胞のような細胞系を用いて調製され、一次貪食細胞と混合される。数時間のインキュベーションの後、ファゴサイトーシスのレベルを評価するために、ファゴサイトおよび貪食ファゴサイトの総数を数える。この方法の洗練された改変として、Nagataのグループは、アポトーシス細胞がアポトーシスDNA断片化を起こさないカスパーゼ耐性ICAD（カスパーゼ活性化DNアーゼ阻害剤）を発現する細胞を用いたex vivo食作用アッセイを開発したが、細胞は貪食される。これらの細胞を食作用アッセイにおいてアポトーシス標的として使用する場合、貪食されたアポトーシス細胞のDNAのみが断片化され、TdT媒介dUTPニック末端標識（TUNEL）によって染色される。したがって、アポトーシス細胞の貪食は、食細胞とアポトーシス細胞の混合物中のTUNELシグナルを計数することによって測定される13 。 キイロショウジョウバエでは、血球、 ショウジョウバエマクロファージ、名前のプロの食細胞がアポトーシスを起こした細胞14、15の食作用を担当しています。培養細胞系を用いたin vitro食作用アッセイに加えて、 ショウジョウバエの全胚を用いたin vivo食作用アッセイが利用可能である。 ショウジョウバエの胚は、多くの細胞がアポトーシスを受けるし、胚発生14、15、16の間に血球によって貪食されているので、アポトーシス細胞の貪食のレベルを調べるための強力なツールです。 インビボ貪食アッセイの一例は、フランのグループによって開発された方法である。彼らの方法では、血球は、ペルオキシダの免疫染色、血球マーカーによってtected、アポトーシス細胞を核染料を用いて染色し、7-アミノアクチノマイシンD全体ショウジョウバエ胚において、二重陽性細胞の数は、貪食17の信号としてカウントされます。胚に対する食作用アッセイの別の例は、上記の永田の方法の概念に基づいている。しかしながら、 インビボで食作用は、（ ショウジョウバエカスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ）突然変異体は18、19ハエDCADの胚を用いて評価されます。これらのインビボ食作用アッセイは、インサイチューで食作用を直接観察するのに有用である。しかしながら、貪食細胞の計数段階において可能な偏りを除外することには困難が伴う。なぜなら、その厚さのために全胚細胞中の全ての食細胞およびアポトーシス細胞を観察することが困難であるからである。 この制限を克服するために、我々はショウジョウバエの胚における新しい食作用アッセイを編集した。我々の方法では、貪食細胞を容易に計数するために、全胚を均質化して分散胚細胞を調製する。貪食細胞は食細胞マーカーの免疫染色により検出され、アポトーシス細胞はこれらの分散した胚細胞を有するTUNELによって検出される。分散された胚細胞の使用は、私たちが食作用のレベルを正確に定量するインビトロ貪食アッセイを行ったかのようにインビボ貪食レベルを測定することを可能にする。食作用によるアポトーシス細胞クリアランスが最も豊富な発生段階である、胚20の段階16に発展する場合、このアッセイでは、全ての遺伝子型のハエを用いることができる。この方法は、食作用のレベルを定量的に評価する利点を有し、したがって、 インビボでのアポトーシス細胞の食作用に関与する新しい分子の同定に寄与し得る 。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>whole swine serum</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>55993</td>
			<td>For bloking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treff micro test tube(easy fit)&#160; Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL</td>
			<td>TreffLab</td>
			<td>96. 4625. 9. 01</td>
			<td>For&#160; homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pellet mixer&#160; 1.5 mL</td>
			<td>TreffLab</td>
			<td>96. 7339. 9. 03</td>
			<td>For&#160; homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-0130</td>
			<td>For preparation of embryonic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher SCIENTIFIC</td>
			<td>27250-018</td>
			<td>For preparation of embryonic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP</td>
			<td>KPL</td>
			<td>475-1612</td>
			<td>secondary antibody for 
			stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro- 
			3-indolyl-phosphate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383221001</td>
			<td>BCIP, For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitro blue tetrazolium</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383213001</td>
			<td>NBT, For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Croquemort antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anti-GFP 
			from mouse IgG1&#954; (clones 7.1 and 13.1)&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6520</td>
			<td>secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S7100</td>
			<td>For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine 
			tetrahydrichloride</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>11009-41</td>
			<td>DAB, For staining of apoptoitc cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Table of Fly Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w1118</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>drpr&#916;5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Itgbn2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>srpHemoGAL4 UAS-EGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described in Br&#252;ckner et al., Dev. Cell., 7, 73-84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-drpr-IR</td>
			<td>VDRC</td>
			<td>4833</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Itgbn-IR</td>
			<td>NIG-fly</td>
			<td>1762R-1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phagocytosis assay for apoptotic cells in drosophila embryos

アポトーシス細胞の食作用の根底にある分子メカニズムは、免疫および炎症性難治性疾患におけるその役割のために、より詳細に解明される必要がある。本発明者らは、本明細書において 、エンザイムリアクションを制御する遺伝子ネットワークが哺乳動物から進化的に保存されているショウジョウバエを用いて、貪食を定量的に調べる実験的方法を開発した。全動物を用いて貪食細胞および貪食細胞を正確に検出および計数するために、 ショウジョウバエ胚をホモジナイズして、貪食細胞およびアポトーシス細胞を含む分散細胞を得た。分散胚細胞の使用は、我々は全体の胚では、すべての食細胞およびアポトーシス細胞を観察し、正確に食作用のレベルを定量化することも可能であるインビトロ食作用アッセイを行ったかのようにin vivoでの食作用のレベルを測定することが可能になります。この方法が以前の研究のものを再現することを確認したアポトーシス細胞の貪食に必要な遺伝子を同定した。この方法は、死細胞の貪食を分析することができ、 ショウジョウバエの強力な遺伝学と組み合わせると、貪食細胞によるアポトーシス細胞の遊走、認識、貪食、分解からなる複合貪食反応を明らかにする。

アポトーシス細胞の食作用を調べるために、発育段階16のショウジョウバエ胚を回収し、分散細胞として調製した。血球、 ショウジョウバエマクロファージは、特異的抗体19、21を用いて、血球マーカー「Croquemort」17、22のために免疫細胞化学により染色し、そしてア...

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Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

本明細書では、 ショウジョウバエの分散胚細胞を用いた食作用アッセイを記載する。これにより、in vivoでの貪食レベルを簡単かつ正確に定量化し 、アポトーシス細胞の貪食に必要な新しい分子を同定することができます。

アポトーシス細胞の食作用アッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

phagocytosis-assay-for-apoptotic-cells-in-drosophila-embryos

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JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Unit 1

Cell Death

SCIENTISTS IN ACTION

9.8K ビュー.  Kanazawa University. 本明細書では、 ショウジョウバエの分散胚細胞を用いた食作用アッセイを記載する。これにより、in vivoでの貪食レベルを簡単かつ正確に定量化し 、アポトーシス細胞の貪食に必要な新しい分子を同定することができます。 

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RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

に関与する宿主因子のためのRNAiスクリーニングワク</em使用して>ウイルス感染ショウジョウバエセル

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

免疫・感染学

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

2光子顕微鏡を用いて感染肺における好中球による貪食とNET -形成の直接観察

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

細胞運命を以下に<em&gt; E大腸菌の</emラムダファージによる感染後&gt;

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer segments (POS) can be performed in vitro. Photoreceptor outer segments with stacks of membranous discs containing the phototransduction machinery are continuously renewed in the retina. Spent POS are eliminated daily by RPE cells. Rodent, porcine/bovine and human RPE cells recognize POS from various species in a similar manner. To facilitate performing large series of experiments with little variability, a large stock of POS can be isolated from porcine eyes and stored frozen in aliquots. This protocol takes advantage of the characteristic of photopigments that display an orange color when kept in the dark. Under dim red light, retinae are collected in a buffer from opened eyecups cut in halves. The retinal cell suspension is homogenized, filtered and loaded onto a continuous sucrose gradient. After centrifugation, POS are located in a discrete band in the upper part of the gradient that has a characteristic orange color. POS are then collected, spun, resuspended sequentially in wash buffers, counted and aliquoted. POS obtained this way can be used for phagocytosis assays and analysis of protein activation, localization or interaction at various times after POS challenge. Alternatively, POS can be labeled with fluorophores, e.g., FITC, before aliquoting for subsequent fluorescence quantification of POS binding or engulfment. Other possible applications include the use of modified POS or POS challenge combined with stress conditions to study the effect of oxidative stress or aging on RPE cells.

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

網膜色素上皮細胞に貪食アッセイのためにブタまたはウシの感光体外側セグメントの大規模精製

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Fcγ受容体媒介食作用を評価するために、単球単層アッセイの使用

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the removal of dead cells or foreign particles, and in the resolution of inflammatory responses and tissue remodeling, processes that are mediated by various surface receptors of the AMs. Here, we report methods for the analysis of the phagocytic function of AMs using in vitro and in vivo assays and experimental strategies to differentiate between the pattern recognition receptor-, complement receptor-, and Fc gamma receptor-mediated phagocytosis. Finally, we discuss a method to establish and characterize a P. aeruginosa pneumonia model in mice to assess bacterial clearance in vivo. These assays represent the most common methods to evaluate AM functions and can also be used to study macrophage function and bacterial clearance in other organs.

Here we report common methods to analyze the phagocytic function of murine alveolar macrophages and bacterial clearance from the lung. These methods study in vitro phagocytosis of fluorescein isothiocyanate beads and in vivo phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. We also describe a method for clearing P. aeruginosa in mice.

肺胞マクロファージの貧食能およびマウスにおける細菌クリアランス

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

ミバエショウジョウバエVivo で貪食能アッセイを使用しての細胞性免疫能を評価します。

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

アポトーシス細胞の食作用アッセイ

要約

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この動画の章

に関与する宿主因子のためのRNAiスクリーニングワクウイルス感染ショウジョウバエセル

2光子顕微鏡を用いて感染肺における好中球による貪食とNET -形成の直接観察

細胞運命を以下に

定量的な

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

網膜色素上皮細胞に貪食アッセイのためにブタまたはウシの感光体外側セグメントの大規模精製

Fcγ受容体媒介食作用を評価するために、単球単層アッセイの使用

超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

肺胞マクロファージの貧食能およびマウスにおける細菌クリアランス

ミバエショウジョウバエVivo で貪食能アッセイを使用しての細胞性免疫能を評価します。