インビボファゴサイトーシスアッセイを用いた成人ショウジョウバエのメラノガステル血球の年齢特異的食細胞能力の評価

当社のプロトコルは、血球の食作用を評価し、定量化するための効果的かつ反復可能なアプローチを提供します。この技術の主な利点は、個々の血球内の食作用を定量化し、個々のハエの遺伝子型間の食作用性プロセスの変動を検出できることです。この方法を初めて実行する場合は、完全な手順を実行する前に、可能な限り多くの説明を行う必要があります。

注射用のガラス針を準備して開始します。1ミリメートルの注射器にミネラルオイルを充填し、ナノインジェクターを備えた30ゲージの皮下注射針を取り付けます。引っ張られた毛細血管の端に30ゲージの針を挿入し、ミネラルオイルでそれを埋めます。

30ゲージの針をゆっくりと取り外し、気泡が形成されないようにします。コレットを取り外し、インデントを上にして密封したOリングを置きます。大きなOリングを金属製のプランジャーに置き、引き締めをせずにコレットを取り付け直します。

金属プランジャーを油で満たされたガラス針の鈍い端に挿入し、大きなOリングに挿入してそっと押し下げます。その後、コレットをしっかりと締めます。フルオロまたはpH感受性粒子で針を充填した後、胸郭のステロプリュールプレートにハエを注入する。

緑色の染料がハエに入る場合、注射は成功します。注入されたハエを新しい食品バイアルに入れ、最初と最後のハエが注入された時間を示します。すべてのハエが回復するまでバイアルを横に置き、食べ物に詰まるのを防ぎます。

解剖した立体顕微鏡の下でフライ腹側を上方向に向けます。その後、胸郭に昆虫ピンを挿入し、生殖器の近くの腹部の最も後部端を通して別の昆虫ピンを挿入します。すべてのハエが固定されたら、トランスファーピペットを使用して、ハエをカバーするのに十分な解剖媒体を追加します。

キューティクルはさみで頭を取り出し、腹部の後部ピンのすぐ上に水平切開を行い、次に腹部の最も前端にもう1つ切開します。腹腔を開く2つの水平切開部を接続する垂直切開を行います。鉗子を使用して内臓や組織を取り除き、裏面血管を避けるようにしてください。

必要に応じて、追加のピンを使用してキューティクルのカット端を固定します。その後、キューティクルはさみで胸郭を取り除く。解剖培地を廃棄し、4%PFAの1ミリリットルに交換し、可能な限り光から解剖を保護する。

20rpmで揺れながら、室温で15分間分の切片を固定します。その後、固定液を取り除き、1X PBSTの1ミリリットルを追加します。必要に応じて、解剖を抗体で染色する。

顕微鏡スライドにキューティクルを取り付けた後、鉗子を使用して腹側を上に向け、後側の容器が見えるようにします。若年ハエとは、背部血管に沿った血球の蛍光画像化によって食細胞化を行う年齢特異的能力について評価した。心膜に対する抗体を使用して、後回し血管に沿った細胞のみがカウントされるようにした。

蛍光標識された大腸菌粒子は長さが1マイクロメートル、ヘモサイトの直径は10マイクロメートルであるため、DAPI陽性核を中心とする直径10マイクロメートル以内の蛍光事象のみをカウントした。その後、ImageJ ソフトウェアを使用してイベントを定量化しました。この手順を試みる場合は、ハエが実際に注入されたことを視覚化し、タイミングが重要であることを覚えておくことが重要です。

注射と解剖をタイムリーに完了すると、実験エラーや貪食率の変動を最小限に抑えることができます。この技術により、研究者は、細胞性免疫、血液細胞の異なる集団、または正常な免疫応答中のAMP産生と食道細胞症の区別に関する質問を含む様々な研究トピックを探求することができます。