This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.

収穫動物と筋肉のための適切な識別子を持つ筋肉の保管に使用するコンテナにラベルを付けます。それが追加されたときに袋/容器および器具は、組織の凍結/融解を防止するために予備冷却する。 筋肉組織収集のために1。研究 - 設計上の考慮事項<ol><li>小動物モデルでは、多くの場合、病理学的研究のための十分な筋線維のサンプリングを提供するために、全体の筋肉の評価を必要とするので、筋疾患の小動物（ネズミ）のモデルでは、研究のために全体の筋肉を使用しています。筋肉疾患の大型動物（犬）のモデルでは、その横（断面）の局面において、少なくとも0.3×cm以上である筋肉の部分を使用しています。 NOTE：コア生検を用いることもできるが、サンプリングの問題に起因する主要な特徴付け研究のための最適以下であり得る。 </li><li>サルコメアを含む研究では、筋節の長さの超微細構造の測定は、重要なエンドポイントを含むことができてもよいのrequ特殊な取り扱いをIRE。これはネマリンミオパチーのいくつかの原因のような筋節のショーの要素不適切な長さ、病気で通常は関連しています。いくつかの研究室ではなく、非引っ張らまたは無延伸の筋肉にこれらの測定を実行するよりも、その非収縮したり伸長状態で筋肉を修復することを好む。 <ol><li>筋節の長さが測定できない場合は、（試薬を参照）希望のEM固定液に直接配置することで筋肉をプレストレッチなしで筋肉組織を修復。 </li><li>筋節の長さが測定される場合には、予め延伸筋肉へのいくつかの技術は、（説明を参照）を使用することができる。 <ol><li> （試薬を参照）、それは動物の中にある間、その静止張力で筋肉を保持するためのクランプ装置を使用して、クランプの外側の周りの筋肉を切除し、希望のEM固定液に収めます。 </li><li>ストレッチと観察されたのと同様の長さで、（このようなコルクの一部として）表面に筋肉をピンすることは<eそれが動物から抽出された後、インビボにおけるm&gt;。 </li></ol></li></ol></li></ol>理想の研究に適した断片に2。細分単離骨格筋（図1） <ol><li>凍結した筋肉組織学のために： <ol><li> （ステップ1.1参照）サンプリングバイアスを最小にするために、可能な限り指定された筋肉をできるだけ多く含まれるが、これらの標本は、&lt;成果物の凍結を回避するには、約1.5 cmである必要があります。 </li><li>取り扱いの違いによる繊維の大きさの人工的な違いを防ぐために、同様に、同じ研究から、すべての筋肉を扱う。 </li></ol></li><li>電子顕微鏡（EM）の場合： <ol><li>元の筋肉の縦軸に平​​行なサンプルの縦軸と、試料からの筋肉〜0.5×0.2×0.2cmのストリップを切断する。 注：固定液が十分に組織のより厚い部分を貫通しないので、2mm以下で、試料の厚さを維持することは、適切な結果を得るために重要である。さらに、筋肉のような小さな断片の向きがしばしば困難であるとして、それはに筋肉の実際の向き（ すなわち、固定標本の最も長い側面は、筋肉/筋線維の縦向きである）を模倣組織の断片を使用することをお勧めしますEM処理中の取り扱いや混乱を最小限に抑えます。 </li></ol></li><li>細胞培養のための： <ol><li>所望の細胞収量は、細胞培養の確立に必要な筋肉の量に影響を及ぼし得る。小動物から単一の筋（または筋肉の部分）は、細胞培養物を確立するために不十分な細胞数を提供するため、複数の筋から必要に応じて、プール組織よい。 </li></ol></li></ol>電子顕微鏡（EM）のため3。組織固定と処理<ol><li> （試薬を参照）希望のEM固定液に直接、その最も薄い寸法が2mmを超えない筋肉の断片を配置します。 </li><li> fixatiの2-48時間後（試薬を参照）、EM固定剤·バッファ内の筋肉を置く上。 （数週間から数か月）長時間の固定は、EM研究に超微細構造を詳細に失われる可能性があります。 </li><li>処理のためのEM中核施設に送る。 </li></ol>組織学的、生化学的および分子研究のために凍結4。筋<ol><li>組織がタオルに少し付着してまで、徹底的にペーパータオルで試料をブロッティングによって試料の過剰な水分を除去。過剰な水分が筋肉にかなりの凍結アーティファクトを生成します。 NOTE：組織はさらに、ベビーパウダー、それを圧延して乾燥させることができる。彼らは過度に湿った環境にされている場合を除き、この手順は、一般的に筋肉は必要ありません。 </li><li>指向筋肉（ 図2C）のための基盤を提供するために十分なだけの10月で、浅いクリオモールドの底に、またはコルクで10月（またはトラガカントゴムと同様の接着剤）を配置します。凍結前にコルクやクリオモールドラベルを付けることは、検体の追跡に有用である。 </li><li> Carefully区分された筋肉は、10月（ 図2C）に接触しないように、10月から突出している筋肉の大部分が、所望の向きに型の中に筋肉を置く。 </li><li>それは約3〜4センチの深さに達するまで、金属カップにイソペンタンを追加します。 </li><li>熱安全手袋を着用し、デュワーの蓋を取り外します。 </li><li>カップの外側に液体窒素のレベルはカップの内側にイソペンタンのレベルを超えているように、液体窒素と接触する金属カップを置くか、保持します。これらのコンテナの手配をするための戦略を図2に示す。 <ol><li>それはで動作するように煩雑になる可能性があり、バブルの泡を生成し（凍結のためにも十分に冷えている）ように、液体窒素が金属カップに入らないようにしてください。 </li></ol></li><li>それは適切な温度に達したときを決定するイソペンタンを観察します。 （最適には-140℃〜-149℃の間）で適当な温度で、そのように凍結されたイソペンタンの蓋白い小石が（数分後、初期霧の後イソペンタン上で消失している）を形成しますカップの底に、または溶液は、一般に糖蜜の一貫性に濃くなります。この前段階に凍結して凍結atifactsが得られます。 <ol><li>イソペンタンが完全に固体フリーズした場合、その後の使用の前に再度凍結温度にそれを解凍して冷やす。 </li></ol></li><li>あらかじめ冷却鉗子を使用して、約10〜20秒間、イソペンタンに検体やコルク/金型を下ろします。 </li><li>あらかじめ冷却した容器の中に凍結した試料を置きます。 </li><li> -80℃の冷凍庫に移すまで、すべての回で、ドライアイス上の標本と箱は保管しておいてください。 </li></ol>アーティファクトは、既に凍結した組織に存在する凍結した場合5。、それは、以下の「解凍し、再凍結」の手順を使用してアーティファクトを凍結度を向上させることができる<ol><li> 一度冷凍庫、1からブロックを取る、ドライアイス上に保管してください。このプロトコルのタイミングは非常に重要です。一度に1つのブロックを解凍し、再凍結。 </li><li> RTにドライアイスからサンプルを移動させます。 </li><li>サンプルは10月中に埋め込まれている場合は、メスを用いて可能な限り完全に周囲の10月を削除します。 </li><li>サンプルは、それが完全に解凍された時点までではなく、それが乾燥した時点に、RTで解凍することができます。 <ol><li>静かに試料が完全に次のステップに進む前に解凍されることを保証するためにピンセットで試料を突く。 </li></ol></li><li>ステップ4.1から4.10に指定されている筋肉を凍結する。 </li></ol>スキニング単繊維機能テストのための筋肉の6。準備<ol><li>筋ための記憶手順は、筋肉/ファイバが実験に使用されているときに依存する。 <ol><li>数週間内で使用するために、ソリューションをリラックス50％glycerol/50％の溶液中で筋肉を置く（試薬を参照）、-20℃で保存</li><li>使用前後のため75パーセントglycerol/25％リラックス液の溶液中で筋肉を置き、数週間ER（試薬を参照）、-80℃で保存</li><li>代わりに、-80℃でコルクに筋肉乾燥、ピンを聞かせて、シリカ顆粒上のストアこれらの脱水筋肉は年間使用することができる。 </li></ol></li></ol>外研究所に細胞培養物の出荷のための新鮮な筋肉の7。準備細胞培養物の確立のためのプロトコルは、他の場所で4-7十分に記載されている。 <ol><li>無菌完全な増殖培地を用いて50 mlの滅菌コニカルチューブを埋める。 </li><li>完全にメディアで組織を浸す、滅菌ピンセットを用いて、チューブに筋肉組織を追加します。 <ol><li>輸送中の乾燥を防ぐために、メディアとチューブの残りを埋める。 </li></ol></li><li>発泡スチロールの箱に氷パックを追加し、いくつかのアイスパックの近くにコニカルチューブを配置します。 <ol><li>唯一のアイスパック（としない​​ドライアイス）を使用する必要があることに注意してください液体および組織の凍結による損傷を防止することができる。 </li></ol></li><li>船舶パッケージO / Nが、組織がこれらの条件下で2日間続くことができる。 </li></ol>

<ol>
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著者らは、開示することは何もありません。

骨格筋は、構造的および機能的にユニークな組織であり、特殊な製造手順は、構造的および機能的パラメータの最適評価を可能にするために必要である。種々の組織は、一般的に、臨床と研究の文脈での病理学的研究のために凍結されていますが、非筋肉組織のための凍結プロトコルは、通常、凍結前に10月中の組織の総浸漬することを含む。 図3に示すように、このようなプロトコルは、骨格筋の病理学的評価には適していないと、まだ、これは一般的に発生するエラーであることをここに記述されたプロトコルに十分類似しています。この論文の目的は、このような問題を回避するために、筋肉を適切に処理するための簡単​​なプロトコルを提供することです。アドバイスもWHE例に外側コア研究所による高品質なデータの取得を容易にする目的で、オフサイトの生理学的および細胞の研究のための筋肉の適切な取り扱いにコンパイルされている再オンサイト研究は望ましいか、可能ではありません。 このプロトコルで述べたように、病理学的研究のために筋肉の適切なプロセシングに必要不可欠な要素は、組織の水分含有量を最小化する筋肉が凍結する温度を低下させる、凍結が達成される速度を増加させることが挙げられる。 （液体窒素で遭遇するように、不十分な温度によって、または凝固剤と組織との間の直接接触の欠如によって生成される）組織または凍結プロセスの過剰な遅内の過剰な水分は、病理学的分析が損なわれる可能性がアーチファクトを凍結につながる。 10月には、組織の水分の追加のソースを提供するので、多くの研究室は、埋基質としてトラガカントガムのような他の接着剤を使用しています。凍結が適切に行われている場合であっても、介護はその後、誤って、RTコンテナや楽器との接触を介して標本を解凍しないように注意する必要があります。したがって、成功した凍結工程は、使用するすべての機器および容器の予備冷却を含む計画の程度を必要とする。凍結アーティファクトが発生した場合、ほとんどの病理学的評価のために十分である組織の回復のためにここで説明する方法がある。しかし、この凍結/解凍サイクルは完璧な組織像を提供し、（再凍結組織するのに必要な時間に加えて）組織の他の分子または酵素の研究を損なう可能性があるので、適切な初期凍結プラクティスを使用することは非常に望ましいされません。凍結アーティファクトが予め凍結組織に遭遇した場合において、しかしながら、本明細書に記載の技術は非常に有用であり得る。 EMのための組織の固定および処理前組織収集に計画して必要な特定の技術的な課題を提供することができます。 EMのための検体を採取する最も一般的なエラーは、グルタルアルデヒドのために厚すぎる組織片の使用を含む浸透するE。グルタルアルデヒドのみ与えられた表面から筋肉組織に約0.1センチメートルを貫通するように、お手入れは、EMのサンプルの1次元は0.2センチメートルよりも厚くなっていないように注意する必要があります。 EMに直接収縮装置を評価する優れた手段であるとしてさらに、一部の研究者は、戦略を開発した筋肉固定前に事前張力またはプレストレッチ生理的に適切な張力で収縮要素の測定を可能にする。そこに事前緊張のための標準プロトコルはありませんが、2つの戦略を簡単に、このプロトコルで説明されています。それは彼らが非常に特殊な方法で行われており、それは非標準を通じて筋節の長さの人為的な変更を防止するたるみの状態で筋肉を固定することが好ましいかもしれない限り、筋肉が予測できない結果を生成することができます事前にテンションを試みることを注意すべきであるプレテンション手順8,9。ほとんどのBを含む、このような特定の測定が必要でされていない筋肉（のための臨床目的のために行わiopsies）は、筋張力を事前にするための努力は、一般的に行われず、筋肉の形態の主な効果は、筋肉中の筋節の不均一な間隔である。 本論文では、先天性の筋疾患の分野での試験の実施のためのSOPを提供するシリーズの最初を表しており、それが日常的に携帯電話、分子、機能的、生理的に実行する先天性の筋疾患分野で20以上の専門家の努力を表しており、病理学的研究。公開されたSOPの範囲は、今後一年間利用できるようになり、それぞれに必要なプロトコルと適切な出版形式はこのSOP努力の目標は、提供することを目的とするワシントンDCで2013年4月に開催された先天性筋疾患コンソーシアムワークショップで議論された1）mと私たちの分野で使用される慣行とエンドポイントを標準化する先天性の筋疾患分野での必要なテストや標本の分析のためのロードマップできるだけUCH、および2）私たちのフィールドに、新しい研究者のための標準的な慣行上の命令を提供する。私たちは、これらのリソースが私たちの下で研究されたフィールドに新しい研究者の参入を容易にし、このように行うことができる研究の範囲を向上させると確信しています。さらに、慣行の標準化は研究間でデータを比較すると、前臨床および臨床試験を計画し、実行するときにエンドポイントを識別することは非常に参考になります。 この記事の主な焦点は、様々な研究のための適切な凍結組織の準備に関連している一方で、私たちの共同のグループはまた、筋肉標本の病理学的解析に有用なエンドポイントを議論した。現時点では、そこに病理学的解析を実行するときに実行するアプローチの公式合意がなく、異なる様々な研究は、それぞれの疾患のために前に出版物に新たな知見を関連付けるために実行されます。したがって、我々はそれが有用であると考え筋肉の病理学の特性評価における病理学的エンドポイントの計画のための一般的なガイドラインを提案する。研究で病理学を定量化する前に、かなりの思考は1に入れられるべきである）繊維サイズ測定方法、ファイバ型特有の異常や治療効果の2）の可能性、3）異常や影響の可能性が制限される個々の筋肉へ、及び4）研究中の疾患に特徴的な病理学的所見を定量化するための戦略。繊維サイズはほとんどの研究のために必要なエンドポイントであり、残念ながらそれを定量する方法で豊富なバリエーションがあります。多くの研究では、独自の画像処理ソフトウェアが提供する自動化された定量法を用いてこれらの結果を報告しますが、これらのプログラムの多くは、これらの自動化された測定値が不正確にレンダリングすることができます（このような繊維は、円または楕円であることを前提として）ショートカットを取る。それは、これらの自動化されたプログラムが、その測定値Bを作る方法を理解することが必要であるお使いになる前の測定値の信頼性を持つ、我々は紙の方法でこれらの詳細を含めることが研究者を奨励する。さらに、繊維サイ ​​ズを表すために使用される特定の測定は非常に可変であり、一部の測定値は、他の10,11よりも好ましい。線維サイズの一般的に使用される測定は、生理学的研究を行う研究者が自分の楽器を使用して得られたCSAの測定を、その結果を標準化するため、特に、繊維断面積（CSA）である。 CSAの測定が正確に完璧な横断面の繊維の大きさを反映することができますが、残念ながら、彼らは広範囲に（縦または斜めに切断した繊維は、人為的に高いCSAの測定値を持つ程度に）、繊維配向に依存しているため、繊維サイズのための理想的な測定ではありません。繊維断面積にあまり依存しない繊維径の好ましい測定は、目の測定値である最小フェレ径（MinFeret直径）である筋細胞12に小径の電子。この測定は、繊維配向にわずかに依存しており、一般的には、繊維の測定のための臨床ゴールドスタンダードであり、研究者は、この技術の使用に向けて移動することをお勧めします。これらの測定は、多くの場合、CSA測定値13を生成する同じソフトウェアを使用して作製され、また、手動で測定することが簡単であることができる。繊維の種類、特定の筋肉、および特定の疾患に関連する病理所見との関連においてに従って病理学的データを評価に関しては、これらは、単に研究の計画時に考慮されるべきであるより少なく論争の問題です。繊維タイプは、免疫組織化学またはATPアーゼ染色を用いて評価することができるが、それは、特定の筋肉や動物種は、これらの繊維タイプの特定の混合物（したがって、異なる期待とテスト戦略を必要とする）があることを考慮することが有用である。筋特異的病理学的関与や治療効果発生し、対照と比較して総筋肉量が病理学的に評価するために、筋肉を決定する前に、疾患の異質性の程度を同定するために用いることができる。最後に、ウェル多くの筋疾患は（例えば、ネマリンミオパチーにおけるネマリン棒のような）特定の病的異常14,15に関連していることが知られているので、それは、これらの異常は、ファイバ型又は筋肉内に見出されるかどうかを検討することも有用である特異的分布の解析16,17を実施する。我々は筋肉の評価のための基準の柔軟性のないセットを提案していないながら、全体的に、我々はこれらの問題は前に任意の骨格筋疾患における病理学的研究の実施に考慮されるべきであると信じています。

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation. 
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models. 
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1111">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For tissue freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device</td>
			<td style="width:107px;">Custom Biogenic Systems</td>
			<td style="width:115px;">Lab-5 Series</td>
			<td>Any other liquid nitrogen dewar could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Cold-conductive container</td>
			<td style="width:107px;">Fisher</td>
			<td style="width:115px;">02-583A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">Nalgene</td>
			<td style="width:115px;">4150-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer</td>
			<td style="width:107px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:115px;">1228Y01</td>
			<td>Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For single fiber functional testing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">08-757-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sylgard coating</td>
			<td style="width:107px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:115px;">&#160;3-6636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Dissection stereomicroscope</td>
			<td style="width:107px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:115px;">693101</td>
			<td>Any other dissection microscope could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sterile laminar flow hood</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:115px;">51022485</td>
			<td>Any other cell culture hood could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Materials</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For tissue freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Plastic bags/containers</td>
			<td style="width:107px;">Nasco</td>
			<td style="width:115px;">B01009WA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Thermal safety gloves</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">G4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Face shield</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">S47640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Long forceps</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">&#160;12-460-807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Marker</td>
			<td style="width:107px;">Staples</td>
			<td style="width:115px;">125328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Sterile 50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">C1060-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">PES filter unit, 500 mL, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">F5227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sterile forceps</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">644320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Ice packs</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">NC9909223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Insulated Styrofoam box</td>
			<td style="width:107px;">Polar Tech</td>
			<td style="width:115px;">207F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Packing tape</td>
			<td style="width:107px;">Staples</td>
			<td align="right" style="width:115px;">795570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Reagents</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Tissue Freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">Airgas</td>
			<td style="width:115px;">NI NF160LT350</td>
			<td>Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Isopentane (2-methylbutane)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">M32631-4L</td>
			<td>Store Isopentane&#160; in a flammable materials cabinet.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:523px;">EM fixative (choose one)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:369px;">The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">16537-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">Karnovsky&#39;s fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer)</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">15732-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For functional studies (if desired)&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Relaxing solution, containing (in mmol/L)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 40 BES</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">B9879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10 EGTA</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 6.56 MgCl2</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5.88 Na-ATP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1.0 DTT</td>
			<td style="width:107px;">RPI</td>
			<td style="width:115px;">D11000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 46.35 K-propionate</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15 creatine phosphate, pH 7.0</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.4 leupeptin</td>
			<td style="width:107px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:115px;">10895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.1 PMSF</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">P7676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Skinning solution, containing&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Relaxing solution (See Above)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.5% Triton X-100</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Indicating silica granules</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Flat pieces of cork (1 x 1 inch)</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">63305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture (if desired)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Growth Medium, containing (for 500 mL)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 &#181;m PES filter unit.&#160; Store at 4&#176;C and use within 1 month.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 395 mL of high glucose Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 100 mL of fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">F6178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Storage requriements</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease

骨格筋は、機能的な細胞、分子、および病理学的評価から最適な結果を得るために、組織収集のための特定のプロトコルを必要とするため、その構造および機能のユニークな組織である。先天性の筋疾患の骨格筋を評価するときのための先天性筋疾患で見られるいくつかの病理学的な異常の繊細さと、これらの機能の認識を妨害する固定用の電位に、凍結された筋肉の病理学的評価は、固定され、筋肉よりも好ましい。他の組織を凍結する際に一般的に使用されていない組織学的検査のために骨格筋を凍結した場合に加えて、筋肉に重度の凍結の成果物を生成する可能性が具体的な予防措置が必要です。この原稿は、最適な骨格筋の形態を維持するために、液体窒素で冷却したイソペンタン（2 - メチルブタン）を用いて、骨格筋の急速凍結のためのプロトコルを記載している。この手順は、fのに有効である遺伝的またはタンパク質発現の研究​​を目的とした組織をreezing。さらに、我々は、収集する必要が最小限の努力に焦点を当て、また、（1）単繊維の機能研究と（2）筋芽細胞培養のための組織の短期トリアージのための好ましい方法を説明して、より広いプロシージャに私たちの凍結プロトコルを統合したこれらの研究を完了するために、専門の研究や参照ラボにそれを組織し、輸送する。全体的に、この原稿は、新鮮な組織が効果的に表現型の様々な研究のために配布することができる方法の概要を提供し、それによって先天性の筋疾患に関連病理学的研究のための標準作業手順書（SOP）を提供します。

不適切な凍結で見られるアーティファクトの例を提供するために、いくつかのマウスの大腿四頭筋は、一般的に、発生したエラーを複製するために異なる技術（ 図3）を使用して凍結した。 図3Aに示されるように、適切に凍結した骨格筋は、周囲の組織（通常は他の筋線維が、時には筋線維間の筋内膜空間は疾患または損傷の様々なプロセスにおいて、線維症または炎症性細胞で満たされている）に筋線維の密な並置を示し、はっきりと目に見える細胞質の区画。それは明らかに、この中の退行性変化、再生、変更、またはその他の特徴的な所見（中心核、細胞内封入体）の存在を同定するために、通常は重大であるように、病理学的分析のために、細胞内空間を表示する機能は、多くの場合、筋内膜コンパートメントよりも重要であるスペース。従って、細胞内区画における氷結晶の存在は、午前表す筋肉の病理学的評価にajor問題。 筋肉組織の適切な凍結は、十分に低温と氷結晶の形成を回避するのに十分な凍結速度の両方を必要とする。両方の要因を占めていても、かなりの凍結アーティファクトは、まだ筋肉組織内であるため、過剰な水分が発生する可能性があります。この問題は、最も一般的には以前に生理食塩水に浸漬し、乾燥が不十分又は筋肉は、OCT（ 図3B、3E）を切片化の部位でメディアをマウントと直接接触したときにされた筋肉組織に遭遇する。 10月にいくつかの接触が実装工程の結果として、通常は避けられないが、あらゆる努力を組織学的に評価され、10月には、実装のために使用される領域の間の接触を避けるためになされるべきである。対照的に、-80°Cの冷凍庫（ 図3C）、液体窒素（ 図3D）を用いて凍結サンプルは例を提供凍結の次善の温度や速度によって生成されたアーティファクトを凍結S。 -80℃の冷凍庫に組織を置くことによって発生した緩慢凍結法は、人工物の凍結の極端な例を提供しています。液体窒素を使用する場合、主な問題は、液体窒素と組織との間の接触は、組織液界面に形成するために気体窒素のシースを引き起こし、この気体のインターフェースが1の凍結迅速筋肉を生成するのに十分に冷たいないことである。これは、試料の表面付近にかなりの凍結アーティファクトを生成することができますが、試料の内部領域が適切な速度でフラッシュ凍結する可能性が高いと、完全に人工物を凍結免れることができる。液体窒素中で筋肉組織の単純な浸漬イソペンタン凍結過程などどこにも近いとして有用であるが、そのような持つ機関での臨床剖検検体としてイソペンタンが利用できない状況（の大きい筋肉標本の凍結するのに便利ですうち臨床筋病理研究所）。 （いくつかの次元で&gt; 2のCM）組織の大部分を使用している場合は、この戦略を使用しての結果は、一般的に優れています。 凍結アーチファクトの回避は、最適な組織学的な結果を提供していますが、この技術は、実質的に不適切に凍結組織を評価することができるように、成果物を凍結逆転させることにも開発されて（本明細書に記載）があります。不適切（ 図3E）凍結された組織を解凍し、繊維内の水の再分配を可能にするために厳密に制御された条件（ 図3F）の下で再凍結し、得られる形態学的保全の程度が優れたものとすることができることができます。我々の経験では、このプロセスは驚くべき程度の組織の細胞内の形態を保持しますが、それは多くの場合、筋内膜空間内の繊維の人工分離を生成します。できるだけ多くの病理学的エンドポイントは、細胞内空間と、それらの中で発見される筋内膜の空間が最高の（線維化を強調したり、他の細胞型を識別するためのいずれか）、特殊な汚れを使用して表示され、これらの人為的な変更は、本当に筋の病理学的評価を損なう可能性は低い。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig1highres.jpg" width="500" /> 図1骨格筋の構造、機能、および細胞研究のための組織のトリアージ。所望の試験の種類に応じて、収集された骨格筋組織は、最適な結果を得るために種々の方法で処理することができる。本論文で概説プロトコルは、専門家中核施設から得られる結果を最適化するために、オフサイトの研究のための骨格筋標本をトリアージや処理するための方法が記載されている。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig2highres.jpg" wiDTH = &quot;500&quot; /&gt; 図2筋の凍結のために使用される装置の例。プロトコールに記載されるように、最適な筋肉の凍結は、凍結温度であるイソペンタンにおける筋組織の浸漬を必要とする。氷冷イソペンタンを得るための安全かつ効率的な手段は、液体窒素を含む周囲のデュワー内で冷却されたイソペンタン用金属容器の使用を含む。それは両手が自由に有することがしばしば便利であるように、2つの液体の混合を防止しつつ、液体窒素中でイソペンタン容器を保持するために、このような（A）をリングスタンドとしてブレースを使用することが可能である。あるいは、容器は、手作業で、液体窒素（B）に保持することができる。イソペンタンは目に見えて（通常は不透明な白い小石など）の容器の底に凍結され、その後、完全な凍結を可能にするために10から20秒間浸漬する必要があるまで、いずれの場合も、組織はイソペンタンに配置すべきではありません。 Isope凍結温度でntaneは、最小限の「霧」を、（かなりの霧が存在する場合、すなわち 、温度が不十分である）を生成する。組織が凍結された後、凍結後に不慮の融解を防ぐために、あらかじめ冷却した容器（そして直接クーラーや冷凍庫へ）に収めます。 （C）を適切にマウントされた凍結した筋肉が凍結し、OCTの底から突出筋肉組織の大部分を持っている必要があります。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" width="500" /> イソペンタン中で適切に凍結図3アーティファクトを凍結し、効果的な解凍/再凍結の例（A）の代表的な画像を適切イソペンタン凍結筋、（B）は、筋肉が、10月に接触して凍結培地、（C）は、筋肉のマウント中-80°Cの冷凍庫内、および（D </強い&gt;）筋肉は、アーチファクトを凍結する、種々の程度の表示の全ては、液体窒素中で凍結した。 （B）に示すように、OCTの高い液体含有量は、それに接触している筋肉の有意な凍結アーチファクト、これだけ取り付けるための、OCTの最小量を使用すべきを生成し、組織学的評価のために筋肉が「起立すべきであるその表面からの「OUT。 （C）-80℃の冷凍庫または（D）液体窒素（氷冷イソペンタン中で凍結速度に対して）を用いて凍結処理の遅さは、有意な凍結アーチファクトの産生をもたらすことができる。 （原因10月との過度の接触に）最初は次善の凍結（E）であり、次に、（F）を解凍し、ここに記載された技術を使用して再凍結と同じ試料からパネルEとFショー筋肉。 1は、再凍結、試料中の繊維の間にいくつかの人為的な分離を観察することができますが、改善のIN筋線維の細胞内形態が容易に明らかである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

組織トリアージや骨格筋疾患のモデルのために凍結

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

39.8K ビュー.  Medical College of Wisconsin. The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

ビデオ: Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

生物学

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

隔離された骨格筋の収縮、倦怠感や交互の ex vivo での評価

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

ゼブラフィッシュ胚骨格筋のレーザー招いた傷害

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

複屈折およびタッチ呼び起こすエスケープ応答アッセイによる幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋の欠陥の分析

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

ヒト骨格筋からの血管由来の多能前駆体の単離

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

骨格筋線維芽細胞からのエクソソームの単離と特性評価

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions can be converted back to NO in mammals through a two-step reduction mechanism: nitrate being reduced to nitrite (NO2-) mostly by oral commensal bacteria, then nitrite being reduced to NO by several mechanisms including via heme- or molybdenum-containing proteins. This reductive nitrate pathway contributes to enhancing NO-mediated signaling pathways, particularly in the cardiovascular system and during muscular exercise. The levels of nitrate in the body before such utilization are determined by two different sources: endogenous NO oxidation and dietary nitrate intake, principally from plants. To elucidate the complex NO cycle in physiological circumstances, we have examined further the dynamics of its metabolites, nitrate and nitrite ions, which are relatively stable compared to NO. In previous studies skeletal muscle was identified as a major storage organ for nitrate ions in mammals, as well as a direct source of NO during exercise. Therefore, establishing a reliable methodology to measure nitrate and nitrite levels in skeletal muscle is important and should be helpful in extending its application to other tissue samples. This paper explains in detail the preparation of skeletal muscle samples, using three different homogenization methods, for nitrate and nitrite measurements and discusses important issues related to homogenization processes, including the size of the samples. Nitrate and nitrite concentrations have also been compared across four different muscle groups.

We present protocols for three different methods for the homogenization of four different muscle groups of rat skeletal muscle tissue to measure and compare the levels of nitrate and nitrite. Furthermore, we compare different sample weights to investigate whether tissue sample size affects the results of homogenization.

硝酸塩および亜硝酸塩測定のためのラット骨格筋ホモジネートの調製

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

マウス骨格筋へのプラスミドDNAのエレクトロポレーション

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring compositional changes in the microbiome is crucial in identifying the functional relationships between these physiological changes. Caenorhabditis elegans has emerged as a powerful host system to examine the molecular drivers of host-microbiome interactions. With its transparent body plan and fluorescent-tagged natural microbes, the relative levels of microbes within the gut microbiome of an individual C. elegans animal can be easily quantified using a large particle sorter. Here we describe the procedures for the experimental setup of a microbiome, collection, and analysis of C. elegans populations in the desired life stage, operation, and maintenance of the sorter, and statistical analyses of the resulting datasets. We also discuss considerations for optimizing sorter settings based on the microbes of interest, the development of effective gating strategies for C. elegans life stages, and how to utilize sorter capabilities to enrich animal populations based on gut microbiome composition. Examples of potential applications will be presented as part of the protocol, including the potential for scalability to high-throughput applications.

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans is a powerful model to examine the molecular determinants driving host-microbiome interactions. We present a high throughput pipeline profiling the single animal levels of gut microbiome colonization together with key aspects of the C. elegans physiology.

線虫Caenorhabditis elegans腸内細菌叢の定量化と分析のためのフローバーミメトリーの応用

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...