マウスの脳内には約1億個の細胞があり、全脳の細胞解像度の画像サイズはテラバイト規模に近づいており、細胞を正確に定量化するには高度な画像解析ツールが必要です。私たちの計算パイプラインは、細胞検出の精度、イメージング時間、および計算リソースの間の合理的な妥協を維持しながら、画像を前処理し、マウス皮質内の核を定量することができます。手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるフェリックス・キエールとイアン・カーティンです。
まず、UltraMicroscope II顕微鏡の定格作動距離により、サンプルがz寸法の深さが5.2ミリメートル以下の方向になるように、サンプルを正しいサンプルサイズホルダーに取り付けます。次に、ホルダーのネジがクレードルのサポートに対して45度の角度になるように、ホルダーをサンプルクレードルに挿入します。次に、サンプルが光路に対して垂直に向けられる位置にクレードルを配置します。
その後、顕微鏡のズーム本体を4倍以上の倍率に設定し、ピクセルあたり0.75マイクロメートルを生成します。「インスペクター Pro」ソフトウェアで、絞り値が約0.08のライトシートを1枚選択します。画像の幅に沿って軸方向の解像度を維持するには、「水平ダイナミックフォーカス」を選択し、レーザー波長に応じて推奨されるステップ数を適用します。
次に、レジストレーションチャンネルに関して各チャンネルのファインフォーカスを調整し、チャンネルプロパティに関してチャンネルごとのレーザーパワーを調整します。次に、ライトシートの幅を約50%に調整して、シートパワーがサンプルサイズのY次元に最適に分散されるようにします。その後、サンプルのサイズに対してタイルの数をタイル間で 15% の推奨オーバーラップに設定し、特定のタイル位置でスタックごとに各チャネルの画像を順番にキャプチャします。
まず、Linux 用の Conda 環境マネージャーと NuMorph 画像処理ツールをダウンロードしてインストールします。コマンドラインで、matlabを実行してNM_setupします。NuMorphからmを使用して、解析に必要な画像解析ソフトウェアパッケージをダウンロードしてインストールします。
次に、ファイル NM_samples.m を編集して、サンプル名、入力ディレクトリと出力ディレクトリ、チャンネル情報、およびライトシートイメージングパラメータを指定します。強度調整の場合、NMp_templateでは、新しい画像セットを操作するときに、調整を true に設定し、use_processed_imagesを false に設定します。次に、save_imagesとsave_samplesをtrueに設定します。
次に、タイル シェーディングを Basic に設定して基本アルゴリズムを使用してシェーディング補正を適用するか、手動に設定して、特定のライト シート幅で UltraMicroscope II の測定値を使用してタイル シェーディング補正を適用します。画像チャンネルの配置については、NMp_template で channel_alignment を true に設定し、チャンネルalignment_methodを平行移動または伸縮性に設定します。次に、sift_refinementを true に設定し、オーバーラップ値を 0.15 に設定して、イメージング中のタイルのオーバーラップを一致させます。
MATLAB で前処理手順を実行するには、サンプル名を指定し、構成を [プロセス サンプルNM_config] に設定します。次に、強度、整列、またはステッチを使用してステージを指定しながらNM_process構成ステッチを指定して前処理ステップを実行し、各ステージの出力ファイルの出力ディレクトリを確認します。3D Atlas 画像と、各ボクセルを特定の構造に割り当てる関連する注釈画像から始めます。
Atlas 画像と注釈ファイルの両方を位置合わせして、正しい方向に正しく一致するようにします。アライメント後、NuMorphでファイルを処理して、コマンドを実行して原稿に記載されている入力を指定します。NMa_template で、resample_imagesを true に設定し、アトラスと一致するように resample_resolution を設定します。
次に、resample_channelsを使用してリサンプリングするチャンネル番号を指定します。その後、register_imagesをtrueに設定し、Atlasディレクトリ内のファイルと一致するatlas_fileを指定し、registration_parametersをデフォルトとして設定します。次に、save_registered_imagesを true に設定します。
核の検出、細胞カウント、および分類では、count_nucleiとclassify_cellsの両方をtrueに設定します。次に、count_methodを3dunetに設定し、min_intensityして、検知されたオブジェクトの最小強度しきい値を定義します。次に、classify_methodを、重心位置での教師なし蛍光強度に基づく閾値、または教師あり線形サポートベクターマシン分類器をモデル化するSVMのいずれかに設定します。
MATLAB で分析手順を実行するには、サンプル名を指定し、サンプルを分析するNM_configするように構成を設定します。次に、リサンプリング、レジスタ、カウント、または分類を使用してステージを指定しNM_analyzeながら、構成ステージを指定して任意の分析ステップを実行し、各ステージの出力ファイルの出力ディレクトリーを確認します。NMe_template で、update を true に設定し、いずれかのインデックスに compare_structures_by を設定します。
次に、細胞カウントと細胞タイプの分類を指定しながら、評価するすべての可能な構造インデックスと構造を指定するテンプレートファイルと構造テーブルを設定します。iDISCO+プロトコルと神経細胞層特異的核マーカーを用いた組織クリアリングにより、同皮質における上層ニューロンと下層ニューロンの細胞群が明確に定義されました。NuMorphを使用した細胞カウントは、強度調整、チャンネルアライメント、ステッチングを含む前処理ステップの成功に依存していました。
ただし、前処理手順のエラーにより、スティッチングが不適切になり、位置合わせやスティッチングが不適切になり、画像の焦点が合ったり焦点が合ったり外れたりする可能性があります。特定の脳領域からの核をカウントするために、ステッチされた画像はアトラスを使用して注釈が付けられ、注釈を脳領域にオーバーレイできます。核の重心は、NuMorphのトレーニング済み3D U-Netモデルで検出され、約1,200万個の全核が同皮質でTO-PRO-3陽性であり、約260万個の脳2陽性核と160万個のCTIP2陽性核がありました。
大脳基底核および海馬同皮質において、それぞれ約3.7および290万個のTO-PRO-3陽性全核が検出された。しかし、これら2つの脳領域で検出された脳2陽性細胞はごくわずかであり、大脳基底核と海馬同皮質でそれぞれ検出されたCTIP2陽性細胞は100万個未満で約1.5個にすぎませんでした。集録中に視覚的な品質チェックを実行して、適切なセグメンテーションを実現します。
また、Conda 環境を適切に設定して、ダウンストリーム解析でエラーが発生しないようにします。細胞カウントに加えて、このパイプラインは、細胞のサイズと形状を測定し、遺伝子型グループ間で比較できる他のセグメンテーションツールとの統合を可能にします。私たちのパイプラインにより、脳の解剖学的構造が細胞の解像度でどのように変化するかを特定し、疾患リスクにとって重要な細胞の種類と脳領域を特定することができます。
