ミニチュアブタからの原発性大動脈内皮細胞の単離と培養

この方法は、内皮細胞をミニチュアブタから単離するための非常に効果的な方法です。そして、細胞も拡張することができ、異種移植における免疫および凝固応答を調査する。技術の主な利点は、豚から高度に精製された内皮細胞を分離することが容易であるだけでなく、非常に効果的であるだけでなく、通路時に他のPAICを維持するためにも優れているということです。

麻酔豚の疼痛反射に対する反応の欠如を確認した後、75%の医療用アルコールとヨウ素の1チンキでブタ腹壁を3回洗浄する。最後の洗浄の後、メスを使用して腹部切開を行い、下の大静脈を露出させ、5ミリリットルの注射器を使用して5000単位のヘパリンナトリウムを下の静脈に注入する。5分後、腹部大動脈にカテーテルを挿入し、メスを使って横隔膜を切開する。

2人目の研究者の助けを借りて、左心室を取り除き、骨鉗子を使って肋骨を切除して心臓と肺を露出させる。心臓と肺に後部大通りを見つけ、端をクランプします。はさみを使って大オータを切除し、あらかじめ冷却した洗浄バッファーで1回洗います。

無菌鉗子とはさみで大腸周囲の余分な組織を取り除き、実験室に移すために新鮮な冷却洗浄バッファーを含む50ミリリットル遠心管に容器を入れます。ブタ大動脈細胞分離の場合は、無菌条件下で豚大動脈を150ミリのシャーレに移し、容器の両端をそっと取り除きます。容器がクランプされた余分な組織を無菌鉗子とはさみでトリミングし、20〜50ミリリットルの新鮮な洗浄バッファーを使用して大腸の外側と内側をすすぎます。

次に、大大通りを通して外科縫合糸を通過し、血管の片端をゆるやかに結び、縫合糸を内腔内に保つ。結ばれた端の近くに大大ターを鉗子で静かに固定し、手術用縫合糸をゆっくりと引っ張り、大間の内皮表面が露出するまで大間を逆にする。大タオルの内皮表面を1回1回10ミリリットルの新鮮な洗浄バッファーで3回洗浄し、大タオルを15ミリリットルの遠心管に入れます。

0.005%コラゲターゼIV消化液を加えた37°Cの10ミリリットルでサンプルを覆い、15分間摂氏37度で組織をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、チューブの内容物全体を100ミリメートル培養皿に移し、10〜15ミリリットルの予冷停止バッファーで消化を逮捕する。細胞スクレーパーを使用して、容器の内面から大動脈内皮細胞を静かに取り出し、洗浄ごとに5ミリリットルの洗浄バッファーで容器を3回洗浄する。

最後の洗浄後、上清を50ミリリットルの遠心分離管に移し、培養皿の底部を5ミリリットルの新鮮な洗浄バッファーで2回洗浄し、1回、洗浄して50ミリリットルチューブで洗浄します。遠心分離によって細胞を収集し、上清の最後の10ミリリットルを除くすべてを捨てます。20ミリリットルの洗浄バッファーを加え、ペレットを再懸濁し、気泡を避けるように気をつけて、別の遠心分離で細胞を採取する。

カウント用の細胞培養培地の1ミリリットルにペレットを再懸濁し、25センチメートル平方フラスコ濃度当たり6個の細胞に10倍の10倍の細胞をプレートする。その後、細胞培養インキュベーターに5%の二酸化炭素で摂氏37度に細胞を入れ、2〜3日ごとに培地をリフレッシュする。単離後、内皮細胞はゼロ、1、2日目、および通路1と2の後に汚染とその形態学的評価について検査される。

抗CD31-FITC抗体を用いたフローサイトメトリック分析は、培養3日目に典型的に97%以上の内皮細胞マーカー陽性集団を示し、2回の通過後も90%以上の純度で維持される。大間の内皮表面は、セルスクレーパーで10回未満で一方向に削り取られ、掻き取りプロセス中に圧縮されなかった。最良の答え、pAECsの分離の最適化された方法は、精製されたpAECを使用して個々の実験を行い、異種移植における免疫拒絶反応および凝固応答を調査することができる。