細かい針の吸引細胞学は、我々は生きているマウスの器官の触知可能な病変からトリパノソームを収集するために使用する安価で、シンプルで、迅速かつ最小限に侵襲的な技術です。細かい針の吸引が非末端の手順であることを考えると、それは時間をかけて同じ動物で繰り返しサンプリングを可能にする。これらの知見を牛に翻訳できれば、この方法は獣医が農場の牛のトリパノソウ症を診断するのに非常に有用であろう。
スミア染色手順を実証することは、私の研究室のアシスタント技術者であるアナ・マルガリーダ・サントスです。開始するには、つま先ピンチ法で麻酔を確認します。脚の引き込みの反射が存在しない場合は、マウスを後方の不屈の状態に置く。
精巣を慎重に触診して上の皮膚からの大きさと距離を決定し、人差し指と中指の間、または人差し指と親指の間で拘束します。ターゲットをさらに固定するには、上の皮膚をしっかりと伸ばし、アルコール拭きで表面をきれいにします。次に、5ミリリットルのシリンジに接続された23ゲージ針の針先をターゲットに挿入し、プランジャーが静止状態であることを確認します。
吸引を適用するには、シリンジプランジャーを3〜4ミリメートルマーク2〜3回に引き込む。代表的なサンプルを得る確率を高め、精巣上体のような小さな構造を標的にするために、臓器内の針を直線またはいくつかの異なる接線に沿ってリダイレクトします。吸引を放し、針を引き出します。
針は、気圧を放して負圧が解除された後にのみ除去することができます。それ以外の場合は、吸引は注射器に吸い込まれ、回復不可能です。穿刺部位で滅菌ガーゼスポンジで圧力をかけ、出血を制御します。
注射器を針から外し、空気で満たします。針を再接続し、針の先端をスライドの近くまたはスライド上に置き、針の内容物をスライドに静かに取り出します。複製サンプリングを確実に行うために、臓器および動物ごとに少なくとも1つの追加の吸引を行う。
生理食塩水で1キロ1ミリグラムの200マイクロリットルの皮下注射で麻酔を戻した後、回復のために動物を自宅のケージに戻す。非支配的な手を使用して、親指と人差し指の間に曇った端をつまむ吸引の滴を持つスライドを拾う。支配的な手を使用して、きれいなスプレッダースライドを拾い、約30度の角度でドロップの上にちょうど2番目のスライドを横切って滑らかなきれいなエッジを置きます。
薄膜を得るためには、1つの光の連続的かつ安定した動きでスライドを前方に滑ります。スライドを休ませ、材料の完全かつ速い空気乾燥を可能にします。スライドの曇った端に鉛筆でラベルを付けます。
Giemsa染色プロトコルの場合、100%メタノールを含むコプリン瓶にスライドを5分間浸して空気乾燥スミアを固定します。その後、スライドを20%ギムサ溶液を含むコプリン瓶に移し、水を30分間蒸留します。蛇口の水でスライドを洗い流し、ティッシュペーパーで十分に乾燥させます。
スライドを水平に保持しながら、無水の取り付け媒体をスミアに数滴塗布します。カバーガラスの端をスライドの上に置き、下げ、静かに押して気泡を取り除きます。免疫細胞化学の場合、空気乾燥したスミアを室温で100%メタノールで10分間固定します。
1X PBSでスライドを5分間洗浄し、1X PBSを毎回新鮮な1X PBSを使用してこのステップを3回繰り返します。コプリン瓶からスライドを取り外した後、スミアに触れることなく余分なバッファを拭き取り、撥水ペンで塗りつぶしの周りに線を引きます。スライドを水平に保持しながら、希釈された一次抗体溶液の150マイクロリットルを各スミアに塗布し、室温で1時間インキュベートします。
インキュベーション後、1X PBSでスライドを5分間洗浄し、毎回新鮮な1X PBSを使用してこのステップを3回繰り返します。スライドを水平に保持しながら、市販の馬根ペルオキシダーゼDABビジュアーゼシステムの150マイクロリットルを各スミアに塗布し、室温で30分間インキュベートします。PBSでスライドを5分間3回洗います。
その後、ハリス・ヘマトキシリンを含むコプリン瓶にスライドを10秒間浸漬して対抗する。水道水で洗い流し、紙を塗って十分に乾燥させます。スライドを水平に保持しながら、無水の取り付け媒体をスミアに数滴塗布します。
カバーガラスの端をスライドの上に置き、下げ、静かに押して気泡を取り除きます。良質のスミアは、良好な密度と保存形態学的特徴を有する細胞の単層によって特徴付けられており、起源の組織と互いの相対的な割合を同定することを可能にした。さらに、寄生虫は効率的に免疫染色され、識別可能で、計数可能であった。
貧弱または負の細かい針の吸引結果は、あまりにも少ない材料に起因し、したがって、質量または器官の代表下にある可能性があります。また、単一のスライド上の材料が多すぎて、過度に厚い塗りつぶしを行い、細胞学的評価を損なう可能性もあります。いわゆる破砕されたアーティファクトは、スミアが破壊された細胞に残るときにあまりにも多くの力が加えられるため、多くの裸の核およびDNA筋が生じるためです。
スミア調製中に十分な力が加えられない場合、細胞は分解されず、細胞の形態学的特徴の評価を妨げる層層が生じる。微細針吸引細胞病理学と組織病理学との比較は、細胞病理学により良い保存された細胞形態と、細胞の相対的な割合およびカウントのより良い評価の利点を有した。免疫細胞化学は、免疫細胞化学よりも簡単で、より速く、そして最適化が容易です。
細かい針の吸引のために、常に動物の良好な固定化、吸引される器官または質量の安定化、および協調された真空の適用および放出を保障する。その後、高品質のスミアのために、材料がガラスの上に置かれた直後に広がり、細胞が砕いたアーティファクトを避けるために塗りつぶすために適用される強度に優しくします。定期的な顕微鏡検査や免疫細胞化学に加えて、この材料は電子顕微鏡、生化学的分析、フローサイトメトリー、分子生物学、あるいはインビトロアッセイにも使用できます。
この技術により、細かい針の吸引を使用して実験動物の病気を診断し、研究できることを実証することができました。トリパノソーマ寄生虫の栄養症を外部の男性生殖器官に診断し、感染の過程でこの疾患を特徴付けることができた。
