La citologia dell'aspirazione dell'ago fine è una tecnica economica, semplice, rapida e minimamente invasiva che usiamo per raccogliere tripanosomi da lesioni palpabili negli organi nei topi vivi. Dato che l'aspirazione dell'ago fine è una procedura non terminale, consente il campionamento ripetuto nello stesso animale nel tempo. Se questi risultati possono essere tradotti in bestiame, questo metodo sarà molto utile per i veterinari per diagnosticare la tripanosomiasi nei bovini in un'azienda agricola.
A dimostrare la procedura di colorazione dello striscio sarà Ana Margarida Santos, assistente tecnologa del mio laboratorio. Per iniziare, confermare l'anestesia con il metodo di avvicinamento delle dita dei piedi. Quando il riflesso della retrazione della gamba è assente, posizionare il mouse in recumbency dorsale.
Palpeggiare attentamente i tester per determinare le dimensioni e la distanza dalla pelle sovrascritta e quindi trattenerla tra l'indice e il dito medio o tra l'indice e il pollice. Per immobilizzare ulteriormente il bersaglio, allungare saldamente la pelle sovrascriva e pulire la superficie con salviette alcoliche. Quindi, inserire la punta dell'ago di un ago calibro 23 collegato a una siringa da cinque millilitri nel bersaglio assicurandosi che lo stantuffo si trova nello stato di riposo.
Per applicare l'aspirazione, ritrarre lo stantuffo della siringa sul segno da tre a quattro millimetri da due a tre volte. Per aumentare la probabilità di ottenere un campione rappresentativo e di colpire strutture più piccole come l'epididimo, reindirizzare l'ago all'interno dell'organo in linea retta o lungo diverse tangenti. Rilasciare l'aspirazione e quindi ritirare l'ago.
L'ago può essere rimosso solo dopo che la pressione negativa è stata rilasciata lasciando andare lo stantuffo. Altrimenti, l'aspirazione viene risucchiata nella siringa ed è irrecuperabile. Applicare pressione con una spugna di garza sterile nel sito di puntura per controllare eventuali sanguinamenti.
Scollegare la siringa dall'ago e riempirla d'aria. Ricollegare l'ago, posizionare la punta dell'ago molto vicino o anche sullo scivolo ed espellere delicatamente il contenuto dell'ago sullo scivolo. Per garantire il campionamento replicato, eseguire almeno un'aspirazione aggiuntiva per organo e animale.
Dopo aver ripristinato l'anestesia con un'iniezione sottocutanea di 200 microlitri di un milligrammo per chilogrammo di Atipamezole in salina, riportare gli animali nella loro gabbia di casa per il recupero. Usando la mano non dominante, raccogli la diapositiva che ha la goccia di aspirata che pizzica l'estremità smerigliata tra il pollice e l'indice. Usando la mano dominante, prendi uno scivolo dello spargitore pulito e posizionalo un bordo pulito e liscio attraverso la seconda diapositiva appena sulla parte superiore della goccia con un angolo di circa 30 gradi.
Per ottenere una pellicola sottile, scivolare in avanti con un movimento leggero continuo e costante. Riposare lo scivolo e consentire l'asciugatura completa e veloce dell'aria del materiale. Etichettare il bordo smerigliato della diapositiva con una matita.
Per il protocollo di colorazione Giemsa, fissare gli strisci essiccati all'aria immergendo gli scivoli in un barattolo coplin contenente 100% di metanolo per cinque minuti. Quindi trasferire le diapositive in un barattolo coplin contenente soluzione 20%Giemsa e acqua distillata per 30 minuti. Risciacquare gli scivoli in acqua del rubinetto e tamponare con carta velina per asciugare accuratamente.
Tenendo lo scivolo orizzontalmente, applicare diverse gocce di mezzo di montaggio non acquoso sullo striscio. Posizionare il bordo di un vetro di copertura sullo scivolo, abbassarlo e premere delicatamente per rimuovere eventuali bolle d'aria. Per l'immunocitochimica, fissare gli strisci essiccati all'aria in metanolo al 100% a temperatura ambiente per 10 minuti.
Lavare lo scivolo per cinque minuti in un barattolo Coplin con 1X PBS ripetendo questo passaggio tre volte utilizzando ogni volta 1X PBS fresco. Dopo aver rimosso le diapositive dal barattolo coplin, pulire il buffer in eccesso senza toccare lo striscio e disegnare una linea intorno allo striscio con una penna idrorepellente. Tenendo lo scivolo orizzontalmente, applicare 150 microlitri di soluzione di anticorpi primari diluiti su ogni striscio e incubare per un'ora a temperatura ambiente.
Dopo l'incubazione, lavare le diapositive per cinque minuti in un barattolo coplin con 1X PBS ripetendo questo passaggio tre volte utilizzando 1X PBS fresco ogni volta. Tenendo lo scivolo orizzontalmente, applicare 150 microlitri di sistema di visualizzazione DAB perossidasi di ravanello perossidasi disponibile in commercio su ogni striscio e quindi incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare nuovamente le diapositive tre volte per cinque minuti in PBS.
Quindi controbilancia immergendo le diapositive in un barattolo coplin contenente ematossilina Harris per 10 secondi. Risciacquare in acqua del rubinetto e tamponare con carta per asciugare accuratamente. Tenendo lo scivolo orizzontalmente, applicare diverse gocce di mezzo di montaggio non acquoso sullo striscio.
Posizionare il bordo di un vetro di copertura sullo scivolo, abbassarlo e premere delicatamente per rimuovere eventuali bolle d'aria. Uno striscio di buona qualità è stato caratterizzato da un monostrato di cellule con una buona densità e caratteristiche morfologiche preservate che consentono l'identificazione del loro tessuto di origine e proporzione relativa tra loro. Inoltre, i parassiti erano efficacemente immunosostenibili, identificabili e contabili.
Risultati di aspirazione dell'ago fine scadenti o negativi possono essere dovuti a materiale troppo scarso e quindi sotto il rappresentante della massa o dell'organo. Può anche essere dovuto a troppo materiale su un singolo scivolo che fa strisci troppo spessi e compromette la valutazione citologica. Il cosiddetto artefatto schiacciato si verifica a causa dell'applicazione di troppa forza quando si fa lo striscio lasciando alle cellule interrotte con conseguente molti nuclei nudi e striature di DNA.
Quando non viene applicata abbastanza forza durante la preparazione dello striscio, le cellule non si disaggregate con conseguente strato stratificato che impedisce la valutazione delle caratteristiche morfologiche delle cellule. Confronto tra citopatologia dell'aspirazione dell'ago fine e istopatologia, la citopatologia ha avuto il vantaggio di una morfologia cellulare meglio preservata e di una migliore valutazione delle proporzioni relative e del conteggio delle cellule. L'immunocitochimica è più semplice, veloce e più facile da ottimizzare rispetto all'immunoistochimica.
Per l'aspirazione dell'ago fine, garantire sempre una buona immobilizzazione dell'animale, stabilizzazione degli organi o della massa da aspirare e un'applicazione e rilascio coordinati del vuoto. Quindi per strisci di alta qualità, immediatamente sparsi dopo che il materiale è stato posizionato sul vetro ed essere delicato sulla forza applicata per fare lo striscio per evitare manufatti schiacciati dalla cella. Oltre alla microscopia di routine e all'immunocitochimica, questo materiale può essere utilizzato anche per microscopia elettronica, analisi biochimica, citometria del flusso, biologia molecolare o anche per saggi in vitro.
Questa tecnica ci ha permesso di dimostrare che l'aspirazione dell'ago fine può essere utilizzata per diagnosticare e studiare le malattie negli animali da esperimento. Siamo stati in grado di diagnosticare il tropismo dei parassiti del trypanosoma agli organi riproduttivi maschili esterni e anche di caratterizzare questa malattia nel corso dell'infezione.
