İnce iğne aspirasyon sitolojisi, canlı farelerde organlardaki palpabl lezyonlardan tripanozomları toplamak için kullandığımız ucuz, basit, hızlı ve minimal invaziv bir tekniktir. İnce iğne aspirasyonunun terminal olmayan bir işlem olduğu göz önüne alındığında, zaman içinde aynı hayvanda tekrarlanan örneklemeye olanak sağlar. Bu bulgular sığır tercüme edilebilir, bu yöntem veterinerler için çok yararlı olacaktır bir çiftlikte sığır larda trypanosomiasis tanısı.
Smear boyama prosedürünü gösteren Ana Margarida Santos, laboratuvarımdan yardımcı teknoloji uzmanı olacak. Başlamak için, parmak sıkıştırma yöntemi ile anestezi onaylayın. Bacağın geri çekilmesi refleksi olmadığında, fareyi dorsal recumbency'ye yerleştirin.
Dikkatle boyutu ve üstteki cilt ten mesafe belirlemek için testisler palpe ve daha sonra işaret ve orta parmak arasında veya işaret parmağı ve başparmak arasında dizginlemek. Hedefi daha fazla hareketsiz hale getirmek için, üzerini sıkıca gerin ve yüzeyi alkol mendilleriyle temizleyin. Daha sonra, beş mililitrelik şırıngaya bağlı 23 kalibrelik bir iğnenin iğne ucunu hedefe takın ve pistonun geri kalan durumda olduğundan emin olun.
Emme uygulamak için, şırınga pistonlu üç ila dört milimetre işareti 2-3 kez geri çekin. Temsili bir örnek alma ve epididim gibi daha küçük yapıları hedefleme olasılığını artırmak için, düz bir çizgi de ya da birkaç farklı teğet boyunca organ içinde iğne yönlendirmek. Emmeyi bırakın ve iğneyi geri çekin.
İğne ancak negatif basınç serbest bırakıldıktan sonra pistonu bırakarak çıkarılabilir. Aksi takdirde, aspire şırınga içine emilir ve geri alınamaz. Herhangi bir kanamayı kontrol etmek için delinme yerinde steril bir gazlı bez süngerile basınç uygulayın.
Şırıngayı iğneden çıkar ve havayla doldurun. İğneyi yeniden bağlayın, iğnenin ucunu slayta çok yakın veya hatta yerleştirin ve iğnenin içeriğini yavaşça slayta fırlatın. Örneklemeyi sağlamak için, organ ve hayvan başına en az bir ek aspirasyon gerçekleştirin.
Anesteziyi deri altı enjeksiyonla döndürerek kilogram başına bir miligram lık atipamezole salinle, hayvanları iyileşmek için ev kafeslerine geri döndürün. Baskın olmayan eli kullanarak, başparmak ve işaret parmağı arasındaki buzlu ucu çimdikleyen aspire damlası olan slaytı alın. Baskın eli kullanarak, temiz bir yayıcı slayt alın ve yaklaşık 30 derecelik bir açıyla ikinci slayt boyunca pürüzsüz temiz kenar yerleştirin.
İnce bir film elde etmek için, bir ışık sürekli ve sabit hareket ile slayt ileri süzülür. Saydı dinlendirin ve malzemenin tam ve hızlı hava kurumasını bekleyin. Kaydırağın buzlu kenarını bir kalemle etiketleyin.
Giemsa boyama protokolü için, beş dakika boyunca% 100 metanol içeren bir Coplin kavanoziçine slaytlar daldırma tarafından hava kurutulmuş lekeler düzeltmek. Daha sonra slaytları %20 Giemsa çözeltisi ve distile suyu içeren bir Coplin kavanozuna 30 dakika aktarın. Musluk suyunda slaytlar durulayın ve iyice kuruması için kağıt mendil ile dab.
Kaydırağı yatay olarak tutarken, yayma üzerine birkaç damla nonaqueous montaj ortamı uygulayın. Bir kapak camı kenarını kaydırağın üzerine yerleştirin, indirin ve hava kabarcıklarını çıkarmak için hafifçe bastırın. İmmünositokimya için, 10 dakika oda sıcaklığında% 100 metanol hava kurutulmuş yayma düzeltmek.
1X PBS ile coplin kavanozda beş dakika boyunca kaydırağı yıkayın ve her seferinde taze 1X PBS kullanarak bu adımı üç kez tekrarlayın. Coplin kavanozundaki slaytları çıkardıktan sonra, yaymaya dokunmadan fazla arabelleği silin ve su itici kalemle yaymanın etrafına bir çizgi çizin. Kaydırağı yatay olarak tutarken, her yaymaya 150 mikrolitre seyreltilmiş primer antikor çözeltisi uygulayın ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, slaytları coplin kavanozunda beş dakika yıkayın ve 1X PBS bu adımı her seferinde taze 1X PBS kullanarak üç kez tekrarlayın. Yatay slayt tutarken, her yayma için ticari olarak kullanılabilir at turp peroksidaz DAB görselleştirme sistemi 150 mikrolitre uygulayın ve daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka. PBS'de beş dakika boyunca slaytları üç kez tekrar yıkayın.
Sonra 10 saniye harris hematoksilin içeren bir Coplin kavanoziçine slaytlar daldırma tarafından karşı leke. Musluk suyunda durulayın ve iyice kuruması için kağıtla dab. Kaydırağı yatay olarak tutarken, yayma üzerine birkaç damla nonaqueous montaj ortamı uygulayın.
Bir kapak camı kenarını kaydırağın üzerine yerleştirin, indirin ve hava kabarcıklarını çıkarmak için hafifçe bastırın. Kaliteli bir yayma, iyi yoğunluklu ve korunmuş morfolojik özelliklere sahip tek katmanlı hücreler le karakterize edilerek, menşe dokularının ve birbirleri arasındaki göreceli oranın belirlenmesine olanak sağladı. Ayrıca, parazitler etkili immünosüle edildi, tanımlanabilir ve sayılabilir.
Kötü veya negatif ince iğne aspirasyon sonuçları çok az malzeme nedeniyle ve böylece kitle veya organ temsilcisi altında olabilir. Ayrıca aşırı kalın yaymalar yapma ve sitolojik değerlendirme bozan tek bir slayt üzerinde çok fazla malzeme nedeniyle olabilir. Ezilmiş obje denen şey, lekenin bozulmuş hücrelere bırakArak çok fazla kuvvet uygulanması ndan kaynaklanır ve bu da bir çok çıplak çekirdek ve DNA çizgileri ile sonuçlanır.
Yayma hazırlığı sırasında yeterli kuvvet uygulanmadığında, hücreler, hücrelerin morfolojik özelliklerinin değerlendirilmesini engelleyen tabakalaşmış bir tabakayla sonuçlanan ayrışmaz. İnce iğne aspirasyon sitopatolojisinin histopatoloji ile karşılaştırılması, sitopatolojinin daha iyi korunmuş hücresel morfolojisi ve göreceli oranların daha iyi değerlendirilmesi ve hücrelerin sayımı avantajına sahipti. İmmünositokimya, immünohistokimyaya göre daha basit, daha hızlı ve optimize etmesi daha kolaydır.
İnce iğne aspirasyonu için, her zaman hayvanın iyi bir immobilizasyon sağlamak, organların veya kitle nin stabilizasyonu aspire edilecek, ve koordine vakum uygulama ve serbest. Daha sonra yüksek kaliteli yaymalar için, malzeme cama yerleştirildikten hemen sonra yayılır ve hücre ezilmiş eserler önlemek için yayma yapmak için uygulanan mukavemet üzerinde nazik olun. Rutin mikroskopi ve immünositokimyaya ek olarak, bu malzeme elektron mikroskobu, biyokimyasal analiz, akış sitometrisi, moleküler biyoloji, hatta in vitro tahliller için de kullanılabilir.
Bu teknik, ince iğne aspirasyonunun deneysel hayvanlarda hastalıkları teşhis etmek ve incelemek için kullanılabileceğini göstermemizi sağladı. Trypanosoma parazitlerinin tropizmini dış erkek üreme organlarına tanı koyabildik ve enfeksiyon boyunca bu hastalığı karakterize ettik.
