これは、分化のための主細胞に任意の幹細胞株または分化プロトコルに適用することができる簡単な治療法です。1〜2%のDMSOを細胞培養維持培地に添加する必要がある。この技術の主な利点は、多能性幹細胞の分化能力を、分化のために細胞をプライミングすることによって選択した系統に有意に高めることができる点である。
DMSO治療は、細胞が患者由来のiPSCと区別する可能性を高め、細胞補充療法、疾患モデリング、および薬物スクリーニングに使用できるようにします。これは、胚発生中のサブ増殖、分化、および仕様を制御する規制の早期発症を生じさせることができる。DMSO治療は、約50個のヒト胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞株の分化を改善することを実証した。
他の研究室は、マウスや霊長類などの他の種の幹細胞にとって有益であることを示しています。分化の発症の1日前に、DMSOを1または2%の濃度で24時間、典型的な維持培地に加えます。DMSO処理の24時間後、培地を交換し、通常の分化プロトコルを使用して進みます。
原稿の方向に従って細胞を成長させます。細胞が適切な合流性に達したら、それらを解化し、単一の細胞懸濁液を調製する。トリパンブルーなどの生存マーカーを使用して、ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用して生きた細胞を数えます。
24時間DMSO前処理の中で80〜90%の合流を達成するために、細胞を1ウェルあたり500、000〜100万個の密度でコーティングされた6ウェルプレートにプレートします。二酸化炭素インキュベーターで37°Cで24時間細胞をインキュベートします。その後、培地を吸引し、1~2%DMSO溶液に交換します。
細胞が分化する前に24〜28時間インキュベートすることを許可する。48時間インキュベートする場合は、24時間後に培地を新鮮なDMSO溶液に交換してください。3D培養分化を達成するために、細胞懸濁液中の細胞を増殖および収集する。
生きた細胞を数え、ROCK阻害剤を用いた幹細胞培地のコーティングされていない低付着6ウェルプレートにプレートを付けます。典型的には、3Dヒト多能性幹細胞球は24時間以内に形成される。細胞が二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で24時間インキュベートすることを可能にする。
原稿の指示に従って、1〜2%DMSOを事前に温めた幹細胞培地で調製します。インキュベーション後に培地を交換するには、プレートを30度から45度の角度に傾け、細胞球体がウェルの底部に落ち着くようにします。培地を細胞から吸い上げ、DMSO溶液中で徐に再中断します。
細胞が二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で24〜48時間インキュベートすることを可能にする。DMSOを用いた細胞を2D培養用に事前に処理し、ノギンおよびSB431542ストック溶液を調製した。3~4日間のメディア交換のためにノックアウトDMEMで十分な10%ノックアウト血清交換、またはKOSRを準備してください。
原稿に記載されているように、事前に温められたKOSRノックアウトDMEMにノギンとSB431542を加えることによって外胚葉分化培地を準備する。DMSO前処理後、細胞から培地を吸引し、各ウェルに2ミリリットルの分化培地を加える。細胞が二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で3〜4日間インキュベートし、毎日メディアを新鮮な分化因子に置き換えます。
DMSO前処理は非処置細胞と比較して細胞の増殖速度の一過性および用量依存的な減少をもたらす。この増殖の減少は、細胞間接触の増加と関連しており、これは特に2%DMSO処理細胞において顕著である。各胚芽層の原始マーカーに対して細胞が固定および染色されると、2%DMSO前処理が分化された生殖層細胞の割合を増加することが分かる。
例えば、SOX17は、内胚葉細胞を可視化するために染色された。DMSOが中枢神経系前駆細胞型への分化に及ぼす影響を調べるため、ヒト誘発性多能性幹細胞は神経前駆細胞またはオリゴデンドロサイト前駆細胞のいずれかに分化することができる。コントロール細胞と比較して、2%DMSO前処理は神経前駆細胞マーカーPax6の発現を増加させる。
同様に、前処理はオリゴデンドロシテ前駆細胞マーカーOlig2を発現する細胞の割合を増加させる。さらに、初期DMSO治療は、生体内移植後のヒト胚性幹細胞由来細胞機能を改善する。分化された膵臓前駆細胞を免疫不全マウスに移植すると、その機能性はグルコースチャレンジまたはKCl刺激に応答して試験することができる。
細胞機能の改善は、移植後2週間から16週間に顕著である。考慮すべき最も重要な考慮事項は、あなたの幹細胞のサイクリングまたは倍増時間です。DMSO治療の長さは、細胞のサイクル時間と同じである必要があります。
最初のDMSO処理の後、細胞増殖および細胞周期が幹細胞でどのように調節されているかを理解することができ、その治療は細胞周期のG1段階における増殖停止を促進するのに役立つ。この分化された細胞は、疾患関連のメカニズムを理解し、他の細胞タイプとの共培養、腫瘍原性アッセイ、および機能アッセイまたは移植研究で、分化された細胞が疾患表現型を救うことができるかどうかを判断するために使用することができる。
