この作品は、NIH HL109478（KNF）によってサポートされていました。著者は文化にPASMCを分離し、維持する上での支援のためにジーナキムとジョアン·テイラーを認め、感謝する。

ノースウェスタン大学の制度動物実験委員会は、このプロトコルを承認した。 1。新生児マウスから肺動脈の分離 - 一日目<ol><li> 100ミリリットル（最終濃度= 20％）、熱不活性化FBS、5ミリリットル（最終濃度= 1％）ペニシリン/ストレプトマイシンをミックス400ミリリットルM199 - 完全M199メディアを準備します。 </li><li> 5ミリリットル（最終濃度= 1％）ペニシリン/ストレプトマイシンをミックス500ミリリットルM199 -無血清M199メディアを準備します。 </li><li>ミックス0.05グラムアガロースプラス10 mlの滅菌、無血清培地M199 0.05グラム鉄粒子- PAアガロースを準備します。 </li><li> 10ミリリットル滅菌、無血清培地中でミックスM199 0.1グラムアガロース- 肺アガロースを準備します。 </li><li>無菌フィルターこの混合物を80 U / mlの最終濃度で無菌、無血清M199メディアにミックスコラゲナーゼと- コラゲナーゼを準備します。 </lI&gt; <li>マウスを安楽死前に前もって機器のすべてを設定します。 </li><li> PAアガロースと肺アガロースマウスを安楽死直前に沸騰するように設定します。 </li><li>イソフルラン過剰摂取と麻酔薬瓶でマウスを安楽死させるとイソフルランと接触するマウスが子犬許可しないように注意してください。最高の細胞収率は、細胞が死亡した後に、循環中に形成マイクロ凝血塊を避けるために死亡した直後に収穫される場合に得られる。 </li><li>麻酔薬の瓶からマウスを外し、操作ボードにマウスを固定し、マウス、楽器、アルコールで手袋を殺菌。 </li><li>ブレードとメスをロードし、首から劣っ腹部にマウスを切開。 </li><li>マウスの左側腹部を開き、腎臓を露出させて、マウスは、それによって肺の小血管に血栓を避け、血を抜くことができるように腎動脈を切った。 </li><li>のマウスの左サイドに沿ってカットするはさみを使用して、胸骨は、胸郭を開きます。 </li><li>慎重に両側横隔膜をカットし、完全に胸腔を開くためにメスを使用しています。胸腔を開いたままに鉗子やピンを使用してください。 </li><li> PAに向け27 G½インチの針でRVを固執し、肺が（すべての血液が肺循環からフラッシュ）白表示されるまで、滅菌PBSでRV / PA /肺灌流。これは、マウスの大きさに応じてPBSの約3〜5ミリリットル取る。小さな肺血管の血栓形成を防止するために最初にフラッシュすることが重要である。 </li><li>慎重に気管とスレッド1縫合下を露出するために鈍的切開を使用しています。 </li><li>サポートのための気管の下に最小鉗子を入れて、気管に24 Gの血管カテーテルを配置。 IVを置いているかのように血管カテーテルを置きます。 </li><li>ステップ1.16のネジ縫合と気管に血管カテーテルを固定します。 </li><li>沸騰したお湯のうち沸騰PAアガロースを取り、よく混ぜて反転。アガロオリゴを冷却氷の上で渦巻くで約体温にSE。アガロース溶液中に残存する必要があるが、それはPAの細胞を損傷するように熱くならない。 </li><li> 27 G½インチ針でRVを固執し、肺がグレー表示されるまでPAアガロースでRV / PA /肺灌流。アガロース混合物中の鉄粒子は、肺の色がグレー表示になります。これは、マウスの大きさに応じてアガロースPAの約3〜5ミリリットル取る。それはあまりにも速く鉄が気道に漏れることがあり注入としてゆっくり行くことも重要です。 </li><li>沸騰したお湯の肺アガロース外を取るとよく混ぜて反転。その後、氷の上で渦巻くによっておよそ体温にアガロースを冷却する。アガロース溶液中に残存する必要があるが、それが肺の細胞を損傷するように熱くならない。 </li><li>肺アガロースを策定し、気管に24 Gの血管カテーテルにシリンジを取り付けます。完全に肺を膨らませるために気管を通してアガロースを注入。肺はeasieなるR肺が適切に膨張している場合（後述の手順を参照してください）​​ミンチする。 </li><li>心肺ブロックを取り外し、アガロース（〜5分）を固めるための氷冷PBS 25mlの中に沈めること。手術領域をクリーンアップするために、この時間を使用しています。 </li><li>新生児マウス（P7-P21）のために、最善PASMC収量は細胞の1バッチに2-3子犬を組み合わせることから来ている。 PASMCは、最適な細胞の健康や成長のための他の細胞と接触させることを好む。マウスを一回の単離ごとに使用される場合、その細胞は非常にまばらであり、十分に成長しない。一緒に動物、収穫とチル心肺圏を組み合わせ、すべての心肺圏が動物から削除された後、その後ミンチに移動する。 </li><li>この時点以降の不妊のための細胞培養フードに移動します。 </li><li> 10センチ組織培養皿の蓋にチルド肺を置き、慎重に心臓、胸腺、気管、肺からの結合組織を除去します。 </li><li> 10センチ組織培養皿の底に肺を移動するそして約1ミリリットルの氷冷滅菌PBSを追加します。 </li><li> 2メスと非常に小さな部分（1-2㎜）に肺をミンチ。 </li><li>滅菌5ミリリットル血清ピペットの先端を絶つ。ピペットは無菌で50ミリリットルコニカルチューブに肺スラリーをみじん切り。肺組織のすべてが50 mlコニカルチューブに入ったことを保証するためにプレートを洗浄するために追加の無菌氷冷PBSを使用してください。 </li><li>磁石の上に50ミリリットルコニカルチューブを置きます。鉄含有組織が磁石の隣にチューブの側に移動するまで待ちます。肺組織の鉄含有容器の割合に応じて、血管の一部も、この時点で浮かぶことができる。それは血管が含まれている場合、それは不明であるため、フローティング肺組織を吸引しないことをしようとしてゆっくりと慎重にPBSをオフに吸引。 </li><li>再び吸引される肺組織の量を最小限にしようと5mlの滅菌PBSで3回肺ペレットを洗浄する。 </li><li> 3ミリリットルのコラゲナーゼで肺ペレットを再懸濁し、60ミリメートル組織培養皿に注ぐ。しないでくださいこれをピペットしよう、肺の塊は、ピペットの内部に固執する。 </li><li>注入後、チューブをすすぎ、同様に60ミリメートルの組織培養皿にこれを注ぐために追加の3ミリリットルを使用してください。 </li><li> 1時間37℃の組織培養インキュベーターに場所。 </li><li>ピペットは、組織+コラゲナーゼスラリー上下5ミリリットルの注射器で15 G鈍針ですべての大規模な肺の部分が破壊されるまで。組織+コラゲナーゼスラリーは目に見える組織の塊で、この時点では曇りとなります。 </li><li>新しい滅菌50ミリリットルコニカルチューブに注ぎ、磁石に付着する。 </li><li>組織の全てが収集されていることを保証するための完全なM199培地の約5mlの組織培養皿を洗浄し、コニカルチューブにこれを注ぐ。 </li><li>コラゲナーゼ+メディア上清を吸引除去する。今回は非常に少数のフローターがあるでしょう、そしてコンパクトな鉄含有ペレットは磁石の隣にコニカルチューブの側になります。 </li><li> 5ミリリットル完全MEDで洗う3Xイア。これは、コラゲナーゼを不活性化する必要がある。 </li><li>完全培地3mlのを追加し、鉄含有ペレットを再懸濁するために数回上下に混ぜて。 </li><li> 35ミリの組織培養皿に再懸濁したペレットを注ぐ。顕微鏡を用いて、血管の内腔に含まれる鉄粒子と漂っ小血管の断片が存在する。 </li><li>一夜組織培養インキュベーターで組織培養皿（プレートゼロラベル）に置きます。プレートの上にゼロから移行するための最初の細胞は、約50％の線維芽細胞および平滑筋マーカーについて染色に基づく50％のPASMC、です。このプレートはメッキゼロと呼ばれ、最終的には、その後の濃縮工程の後破棄されます。 </li></ol> 2。新生児マウスから肺動脈の分離 - 二日目<ol><li>プレート、ゼロから新しい50 mlコニカルチューブにメディア上清を注ぐ。 </li><li>メディア上清を吸引除去する。今回はそこにほとんどないフローターならない、とコンパクトな鉄コンタますiningペレットは磁石の隣にコニカルチューブの側面に形成することになる。 </li><li> 3倍の5ミリリットル完全なメディアで洗う。 </li><li>完全培地3mlのを追加し、鉄含有ペレットを再懸濁するために数回上下に混ぜて。 </li><li> 35ミリの組織培養皿に注ぐ。顕微鏡を使用して、血管内腔に含まれる鉄粒子と漂っ小血管の破片が見られます。これは、プレート1（ 図1A）となります。 </li><li>組織培養インキュベーター中で組織培養皿を置きます。 </li></ol> 3。新生児マウスから肺動脈の分離 - 6日目<ol><li>プレート1から新しい50 mlコニカルチューブにメディア上清を注ぐ。この工程を複数回繰り返すことにより、容器の壁に常駐して平滑筋細胞の全てが、細胞培養プレートにオフに移行する機会を持つことを保証する。各プレートすなわち各ステップで減少リターンが少なく、細胞が接着する必要がありますがあります。 </li><li&gt;再給紙プレート完全M199メディアとの一つであり、組織培養インキュベーターに戻し入れます。 </li><li>メディア上清を吸引除去する。今回は殆どフローターは存在しません、そしてコンパクトな鉄含有ペレットは磁石の隣にコニカルチューブの側面に形成することになる。 </li><li> 3倍の5ミリリットル完全なメディアで洗う。 </li><li>完全培地3mlのを追加し、鉄含有ペレットを再懸濁するために数回上下に混ぜて。 </li><li> 35ミリの組織培養皿に注ぐ。顕微鏡を使用して、血管内腔に含まれる鉄粒子と漂っ小血管の破片が見られます。これは、プレート2になります。 </li><li>組織培養インキュベーター中で組織培養皿を置きます。 </li></ol> 4。新生児マウスから肺動脈の分離 - デイナイン<ol><li>組織培養皿プレート2から新しい50 mlコニカルチューブにメディア上清を注ぐ。 </li><li>再給紙プレート完全M199メディアと2、および組織文化に戻って配置インキュベーター。 </li><li>メディア上清を吸引除去する。今回は殆どフローターは存在しません、そしてコンパクトな鉄含有ペレットは磁石の隣にコニカルチューブの側面に形成することになる。 </li><li> 3倍の5ミリリットル完全なメディアで洗う。 </li><li>完全培地3 mlを加え、鉄含有ペレットを再懸濁するために数回上下に混ぜて。 </li><li> 35ミリの組織培養皿に注ぐ。顕微鏡を使用して、血管内腔に含まれる鉄粒子と漂っ小血管の破片が見られます。これは、プレート3になります。 </li><li>組織培養インキュベーター中で組織培養皿を置きます。 </li></ol> 5。新生児マウスから肺動脈の分離 - デイサーティーン<ol><li> 1-3プレートのメディアオフを吸引。 </li><li>優しく暖かい、滅菌PBSで細胞を洗浄する。 </li><li>セルをオフトリプシン処理するために、各プレートにトリプシン（〜0.25〜0.5ミリリットル）トリプシンの薄膜を追加します。細胞は非常に粘着性であり、組織cultuでトリプシンにする必要がありますプレートを持ち上げに約10分間再インキュベーター。 </li><li>残留鉄粒子を引き出し磁石に装着50ミリリットルコニカルチューブに5ミリリットル完全なメディアにプレートから細胞を回収。 </li><li>完全なメディアの追加の0.5mlの各プレートを洗浄し、50 mlコニカルチューブにそのメディアを追加します。 </li><li>今回は、メディア上清を（吸引していない）を取ると、鉄粒子ペレットを捨てる。 </li><li>プレート60ミリメートル皿に5ミリリットル完全M199培地中の細胞は数日でコンフルエントの細胞を持っている。また、プレート10ミリリットル完全M199 10センチプレートのメディア、およびPASMCで細胞がコンフルエントに達するために約別の1〜2週間かかります。 </li></ol> 6。新生児マウスから肺動脈の分離 - 14日目<ol><li>残留トリプシンを除去するために新鮮な完全M199メディアにメディアを変更してください。組織培養皿（ 図1B）にPASMCの薄い人口があります。 </li></ol> 7。日常診療<ol><li>週に約2倍の新鮮な完全M199メディアにメディアを変更してください。 </li><li>これらの細胞は、トリプシンの映画の中でインキュベーター内で約10分は（0.25〜0.5ミリリットル）プレートを持ち上げ、細胞分裂のために必要とされる場合。トリプシンのフィルムを使用すると、細胞をスピンダウンせずにPASMCの再播種ができます。あまりに多くトリプシンを使用している場合は、その後PASMCはトリプシンをスピンアウトするように遠心分離しなければならない、または細胞がプレートにreadhereません。ときには、細胞をスピンダウンした後に、それは完全なM199培地中に再懸濁しPASMCを得ることは困難である。 </li><li>観察では、単離されたPASMCは4-5継代確実に平滑筋細胞のように動作しますが、単離された細胞は、上昇通路7に平滑筋細胞マーカーのために染色されます。通路2（トリプシンへの最初の曝露後メッキ）などの日13の最初のプールされた60ミリメートル、10センチプレートをカウントします。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

本稿では、我々は初めてP7、P14、およびP21でマウスからPASMCの単離のため説明しています。これを達成するために、アガロースおよび0.2μMの鉄粒子のスラリーをPAにRVを介して注入される。鉄粒子のサイズが小さいので、彼らは、肺毛細血管床を通過することができず、従って、小さなPAに堆積される。肺は、膨張削除と解離している。鉄含有容器は、磁石を用いて溶液から引き出されている。...

胎盤は、ガス交換の主要な器官として機能し、心拍出量の10％だけが、肺血管床を通って循環されるため、肺高血圧症は、子宮内の生命の間に正常な動作です。 子宮内では 、肺の圧力が上昇し、肺血管抵抗が原因で全身の圧力に類似しています。妊娠が進行するにつれて、肺内の小さなPAの急速な成長は、出生1で生じる肺血流量の劇的な増加のために胎児の調製がある。通常の周産期の移行は短期的とフル期産児に失敗した場合、結果は（PPHN）新生児遷延性肺高血圧症である。 PPHNは、さまざまな基本的な病態に起因する臨床的な症候群である。しかし、これらの乳児のすべてがこのような高められた肺血管抵抗、低酸素血症、動脈管開存症などのような永続的な接続の間または胎児のために血流の右から左への短絡などの一般的な病態生理学的特徴を共有卵円アーメン。 PPHNは出生1,000人あたり2-6に影響を与え、死亡率と同様に重要な短期および長期罹患2の8〜10％のリスクを伝える。さらに、超低出生体重未熟児は、その基礎となる肺疾患の結果として肺高血圧を開発することがあります。未熟児の最も一般的な基本的な肺疾患は、気管支肺異形成症（BPD）です。 BPDの全体的なリスクは、在胎週数と出生体重と相関しながら、これらの乳幼児のサブセットが著しい肺高血圧症を開発し、どのように適切にこれらの乳児を治療する理由、それは不明である。長引く入院や死亡率の増加など、悪い結果は、3-6一般的です。 歴史的には、健康な動物からヒツジ胎児PASMC又はブタ胎児PASMCは出産後に正常肺血管転移に関与するシグナル伝達経路を研究するために使用されている。これらは、典型的には、第五世代の抵抗PAから分離されnのヒツジまたは任意の自発呼吸7-9前に配信され、安楽死させているブタ胎児。さらに、いくつかの研究者が単離され、少し古いからPASMC利用と自発的に3日間、2週間と4週間10-12で子羊や子豚を呼吸している。最近では、いくつかのグループが成功した疾患状態13-17でシグナル伝達経路で撹乱を検討するPPHNと子羊から分離PASMCを分離し、利用してきた。これらの細胞は、シグナル伝達経路は正常と病気の短期的および長期的肺血管系の両方で非常に重要である検討する貴重なツールであることが証明されている。しかし、彼らは、肺高血圧症の未熟児に影響するシグナル伝達経路への洞察を与えることはありません。また彼らは、疾患のマウスモデルに見られる遺伝子操作の可能性を可能にするない。 ラットおよびマウスモデル長いモデルBPDに使用されており、さらに最近で肺HYをモデル化するために使用されているBPD 18-22起因pertension。新生児ラットは彼らの大きなサイズに起因すると動作するように誘導されているが、彼らはまた、遺伝子組み換えの可能性の欠如に苦しんでいます。遺伝的に改変された動物は、広く新生児マウスにおける全体の動物生理学上の特定の遺伝子標的の効果を調査するために、誰が以前に正常にこれらの小さなマウスから単離されていないPASMC今日まで用いられてきた。 PASMCを単離することにより、より大きな情報が経路が環境刺激および/または肺動脈平滑筋特異的遺伝子改変に応じてどのように変化するかについて得ることができる。さらに、ライブPASMCは、カルシウムと活性酸素種23-25 ​​などの主要シグナル伝達分子の急速な変化を調べるために、リアルタイムで画像化することができる。我々は、最近、マーシャルらの手法のバリエーションを用いて成体マウスからPASMCの正常な単離を記載している。26は、ラットPASMC 23,25,26を単離するために用いられる。我々は今、適応しているndは7-21日齢の小さなマウス（P7、P14、およびP21）にこの手法を拡張した。この新しいPASMC分離技術の主な制約は、それが実験のために十分な細胞を作製するために複数のマウスを必要とする細胞は、一次平滑筋細胞の特徴である、非常にゆっくりと成長することである。これらの制限にもかかわらず、我々は新生児マウスPASMCを分離するために、この手法は肺高血圧症の発症に関与する重要なシグナル伝達経路の強化された調査を可能にし、この分野で飛躍的な進歩を表していると考えています。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard Parker surgical blade handle</td>
			<td>BD</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel surgical blades #10 (sterile)</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657 and 306646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 G, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter (24 G, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoject blunt cannula (15 G)</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>SWD202314Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9782896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynal magnet particle collector</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>120-01D</td>
			<td>This is a critical tool for the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353001, 353004, and 353003</td>
			<td>Any brand of tissue culture plates will be fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors (4 &#189; inch stainless steel)</td>
			<td>American Diagnostic Corporation</td>
			<td>3424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (4 inch stainless steel)</td>
			<td>Quick Medical</td>
			<td>L5-5004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 media</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TX16777-164NWU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone/Thermo Scientific</td>
			<td>SH3091003</td>
			<td>Heat inactivate at 55 &#176;C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron particles (iron (II, III) oxide powder)</td>
			<td>Aldrich Chemical Company</td>
			<td>#31,006-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (made to 80 U/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Butlet Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000-U</td>
			<td>Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-desmin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-8281</td>
			<td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-smooth muscle myosin</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>BT-562</td>
			<td>Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-red anti-rabbit secondary</td>
			<td>Molecular Probes/Invitrogen</td>
			<td>R-6394</td>
			<td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE300</td>
			<td>Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-AK800-0001</td>
			<td>This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sildenafil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PZ-0003</td>
			<td>A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice

肺高血圧症は、罹患率と乳児死亡の重要な原因である。歴史的には、胎児の羊からPASMCにおける血管平滑筋の収縮に関わるシグナル伝達経路の重要な研究があった。羊用語肺高血圧症の優れたモデルを作るが、それらは非常に高価であり、マウスに見られる遺伝子操作の利点を欠いている。逆に、マウスからPASMCを分離することができないことは、そのシステムの重要な制限だった。ここでは、マーシャルらの前述の手法のバリエーションを用いP7、P14、P21及びマウスからマウスPASMCの初代培養物の単離を記載している。26は、予めラットPASMCを単離するために使用された。これらのネズミPASMCは新生児期にシグナル伝達経路の研究のための新規ツールを表しています。簡潔には、0.5％（w / v）のアガロース+ 0.5％鉄粒子M199培地中のスラリーは、右心室（RV）を介して、肺血管床に注入される。ザ鉄粒子は、直径が0.2μMであり、肺毛細血管床を通過することができない。したがって、小肺動脈（PA）の鉄のロッジ。肺は削除され、解離アガロースで膨張している。鉄含有容器は磁石でプルダウンされています。コラゲナーゼ（80 U / ml）で処理し、さらに解離した後、容器は、培養皿の上に細胞移動を可能にするために、20％ウシ胎児血清（FBS）および抗生物質（M199完全培地）を含むM199培地中で組織培養皿に入れられ。細胞のこの最初のプレートは、線維芽細胞およびPASMCの50-50混合物である。したがって、手順​​プルダウンはより純粋PASMC集団を実現し、任意の残留鉄を除去するために複数回繰り返される。平滑筋細胞のアイデンティティは、平滑筋ミオシンとデスミンの免疫染色によって確認された。

分離中および後の、PASMCを光学顕微鏡によりおよび平滑筋細胞マーカーの免疫染色の両方によって調べられます。初期のプロトコルにおける光学顕微鏡により、PASMCは血管を（ 図1A）を含む小鉄からの組織培養皿上に移行が見られる。それらは、最終プーリング段階で引き出されているように日に13上の3つを通じてプレートを1つをプールした後、その後、鉄粒子はもはや見られな...

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Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

我々は、それによって新生児の平滑筋細胞の収縮と弛緩に関与するシグナル伝達経路のより良好な研究を可能にする、新規かつP7の幼いマウスからの肺動脈平滑筋細胞の初代培養物（PASMC）を単離するための再現可能な技術を開発した。

新生児マウスから肺動脈平滑筋細胞の単離

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

isolation-of-pulmonary-artery-smooth-muscle-cells-from-neonatal-mice

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K ビュー.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. 我々は、それによって新生児の平滑筋細胞の収縮と弛緩に関与するシグナル伝達経路のより良好な研究を可能にする、新規かつP7の幼いマウスからの肺動脈平滑筋細胞の初代培養物（PASMC）を単離するための再現可能な技術を開発した。

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Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

焦点のCa 2 +</sup平滑筋の>過渡検出

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

生物学

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

ヒト臍帯動脈平滑筋細胞の単離（HUASMC）

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

新生児マウスからの肺血管内皮細胞の単離と培養

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

骨格筋からのミトコンドリア単離

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

新生児肝外胆管細胞を単離する

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

ネズミ弁内皮細胞の単離

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

マウス冠動脈血管平滑筋細胞の単離

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

クリック化学を用いた血管平滑筋細胞の増殖測定

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...