ウェルカムトラストは、財政支援を（JSYとKLBに074128研究フェローシップにVIP賞）を提供。医学研究評議会RJAの学生の身分 Leica_SP2_Stacker、シリーズに&quot;再建&quot;のためにTIFFをインポートするために使用されるアルゴリズムは、トニーコリンズによって開発され、彼の許可を得て使用、ImageJのにライカSP2 TIFFを読み込むためのプラグインは、Leica_tiff_sequenceに基づいています。 （ <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ）StackRegとTurboReg、組織の動きを補正するために使用されるアルゴリズムは、のTh venazら（1998）9に基づいています。 Excel_writer.jarはクルトデボス（http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html）によって書かれました。 JNCT0.08JoVE.ijm、粒子の検出アルゴリズムは、KLの脳と詳細以前に5で書かれたアルゴリズムに基づいています。

パート1：のCa 2 +インジケーター（AMオレゴングリーン488 BAPTA - 1）の調製<ol><li>オレゴングリーン488 BAPTA - 1は、AM粉の少量（50μg）をとして500μlのバイアルで提供されます。粉体へのF - 127ソリューション、30秒間静かに揺れ40μlのプルロニックを追加し、その後、460μlのPSSを追加し、30秒間振とうする最終的な解決には、10μMオレゴングリーン488 BAPTA - 1 AMは、4 ×125μlのアリコートを提供します。 -20℃での光とストアへの暴露を避ける</li></ol>パート2：のCa 2 +ローディング<ol><li> （-20℃）冷凍庫からのCa 2 +インジケーター（オレゴングリーン488 BAPTA - 1 AM）を削除し、室温で解凍することができます。 </li><li>試験管や水浴の場所でPSSの1mlを取る。秒あたりに現れる約1バブルの速度で95％O 2 / 5％CO 2のバブル。バブラーは、栓、またはパラフィルムで、例えば試験管、に保護する必要があります。 </li><li>動物から組織を摘出し、、Sylgardライニングペトリ皿に、慎重に結合組織を取り除く。関係なく、平滑筋臓器のタイプの、PSSは10分ごとに交換する必要があり、組織は、（PSS三回を交換するなど）だけでなく、以下の郭清を洗浄する必要があります。輸精管の場合：ティッシュのシートを生産する器官の長さの方法を切削することを検討してください。膀胱用：ドームの上部（前方）に膀胱頸部（後方）から縦方向に開く。 8 LONG mmおよび1 - - 支配的な筋肉の束の方向に切断排尿筋の背側表面に沿って幅2 mmの4つのストリップ、6を準備します。 </li><li> &quot;事​​前に暖めとバブル&quot;PSSで切除した組織を置きます。 </li><li> 10μMオレゴングリーン488 BAPTA - 1は試験管の午前の125μlを加え、少し振る、手で、ミックスする。 </li><li>箔で覆われ、バブリングと休暇を再開する。時間は、Ca 2を取るのに十分な組織のために引き継ぎます+インジケーターは、組織と平滑筋の層の厚さのサイズによって異なります。例えば：120分（ラットの排尿筋、マウス輸精管）へ70分（マウス排尿筋、ラットのanococcygeus）。 </li></ol>パート3：&quot;Ca 2 +は 、ロードされた&quot;顕微鏡のための組織の準備組織のピニング慎重になることが組織の自発運動（相対的に無傷の組織から平滑筋細胞のイメージングのプロパティ）を最小限に抑え、組織のフラットな作品として撮影するのに適したサイト（の位置を容易にするために必要です。二次元ではなく3つ）で調査した。 <ol><li>少なくとも5分間バブリングPSSの組織をすすいでください。 </li><li>平らなシートを形成するために組織を（わずかに）ストレッチ、Sylgardライニング準備皿にマウントします。 &quot;ピン&quot;として25から50ミクロン径の銀線の代わりに短い長さを使用し、斜めに挿入し、目標を傷つけることがある長い&quot;ピン&quot;を使用することは避けてください。 </li><li> PSSは、皿のSylgardが並ぶエリア（これは、灌流の開始時に、PSSで覆われて大面積を招く場合があります）から逃れることがないように注意しながら、顕微鏡のステージ上に準備皿を置きます。 </li><li> PSSで準備を表面かん流するために、ポンプのスイッチを入れる。時間当たり100mlの速度は、しばしば採用されている。 </li><li>ヒーターユニットに切り替えます。 </li><li>準備の料理（その基盤上に磁石で金属片にそれぞれ貼付）に流入し、流出管及び温度プローブを置きます。流出管の先端の高さは、PSSの深さを決定します。流出が実際に（それは時々最初にしないとして）PSSを除去していることを確認するように注意してください。 </li><li> 、所望の温度に到達するためのヒータユニット上に、例えば33から35℃を温度を設定する</li><li>組織は、少なくとも10分間平衡させる。 </li></ol>パート4：画像へのサイトの選択励起光源への暴露はインジケータが退色しますので、一度に数秒以上使用しないようにしてください。 <ol><li>低消費電力を目的とし（10倍または20倍）平滑筋を表示し、監視するために適切な領域を識別するために、青色光で励起する、落射蛍光使用。運動（最小限でなければなりません）とフィールドでの平滑筋細胞の数：に基づいてサイトを選んでみてください。明るい&quot;構造は&quot;画像の検出アルゴリズムで&quot;偽陽性&quot;の高い数を引き起こすことがありますので、（例えば）散在上皮細胞または線維芽細胞の数が多いサイトにアクセスしないように。 </li><li>より高い電力の目標（40倍）に切り替えます。 </li><li>ステージや平滑筋細胞（の）ので、光軸を回転させる（高速走査軸に、すなわち平行）、水平位置。 </li></ol>パート5：共焦点顕微鏡共焦点顕微鏡は、&quot;設定&quot;する方法の詳細については、各顕微鏡の種類に固有のものですが、重要な考慮事項は次のとおりです。スピード（5 Hzの最小はほとんどのCa 2 +過渡に必要とされる）、フィールドの解像度とサイズ（速度とオフ取引されどち ​​らも）。次のプロトコルのいくつかは、ライカSP2直立共焦点顕微鏡に固有のものです。典型的なプロトコルです：5 Hzの（256 × 256ピクセル、約100 ×100μmである。）で取得した100フレームのシリーズ、または13.5 Hzの（256 × 64ピクセル、約100 ×25μmと。）。走査ヘッドは双方向に移動する（取得速度を最大にする）と、行ごとに1000 Hzで取得するように設定。 <ol><li> 1つの&quot;エアリーディスク&quot;にピンホールを閉じて。 </li><li> AOTFで25〜35％の間レーザー（488 nm）のパワーを設定します。この値は、明るさと光退色との間のトレードオフです。 （後者は長時間録音時に特定の問題である。） </li><li> &quot;治療&quot;あたり6つのサイト - 六つのサイトあたりのシリーズ、および4を取得する。かなりの退色は、実験者はこのから逸脱する可能性がありますが、それは、事前に薬剤（すなわち&quot;コントロール&quot;）とポスト薬剤同じ6つのサイトを監視することを目的とするのが一般的です。 </li><li>それは、&quot;タイムコントロール&quot;が実行されることのCa 2 +イメージングとが不可欠です。 </li></ol>第6部：分析のための準備<ol><li> http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html：からイメージJをダウンロードしてインストールします。プラットフォーム固有のバージョンをダウンロードしてから、http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jarから最新のimageJ.jarファイルをダウンロードし、古いファイルを置き換えることにより、最新のバージョンにアップデートする。アップルMacユーザー：それは徐々に実行される場合は、アップル（http://www.apple.com/macosx/features/java/）から入手可能なJava仮想マシン（JVM）の最新バージョンを使用していることを確認。 </li><li>からExcel_writer.jarダウンロード：http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.htmlをしてプラグイン[ディレクトリ]&gt; jarファイルのディレクトリにインストールします。 </li><li> ; JNCT0.08Release.ijm Leica_SP2_Stacker.class：以下のファイルをPluginsディレクトリにコピーします。プラグインを使用して、これらの各スクリプトをインストール[メニュー]&gt;マクロ&gt;のインストール... ImageJの機能。 </li><li>私たちは、ライカSP2共焦点顕微鏡、ソフトウェア内の単一の表示可能な&quot;映画&quot;として、各系列を生成するためのソフトウェア（ライカLCS）を使用しますが、個々のフレームとして保存されます。シリーズにフレームを再構成するために：（i）は再構築されるすべての&quot;フレーム&quot;は、単一のフォルダ（例：&quot;DataFolder&gt;原告&quot;）になっていることを確認します。 （ⅱ）プラグイン[メニュー]&gt;マクロ&gt; Leica_SP2_Stackerを選択してください。ルートディレクトリ（例えば&#39;DataFolder&#39;）を選択してください。ドロップダウンリスト（たとえば、&#39;TIFFを/&quot;）から目的のフォルダを選択します。出力ディレクトリを選択するか、新しいものを（例えば、&#39;DataFolder&gt;スタック&quot;）を生成します。スクリプトは、個々のフレームからシリーズを再構築します。 </li></ol>パート7：運動を補正画像化されたサイトの動きが良くピンニングと最小化と均一に延伸組織されることがありますが、一部の平滑筋臓器は単独でピニング慎重で廃止することができる自発的な収縮を示す。ここでは、整列またはシリーズ内でのフレームと一致して自由に利用可能なアルゴリズムの使用を説明しています。 <ol><li> &quot;StackReg&quot;（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）と&quot;TurboReg&quot;（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/）をダウンロードしてください。 </li><li>プラグインを使用してプラグインディレクトリにそれぞれをインストールする&gt;マクロ&gt;のインストール... </li><li> （&gt;開くをファイル...）処理されるようにスタックをロードしてから、明らかに興味のある分野を示していますフレームに移動します。他のフレームは、この基準のフレームに配置されます。 </li><li>プラグイン&gt;スタック&gt; StackReg。最も効果的であるかを判別するために別の&quot;変換&quot;（すなわち翻訳、リジッドボディ、スケール回転、アフィン）のそれぞれを試してみてください。 （更なる詳細：http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/） </li></ol>パート8：粒子の検出アルゴリズム各&quot;サイトが&quot;イメージングのために、要因は、Ca 2 +トランジェントの検出に影響を与えることが異なります。各サイト（&quot;粒子のパラメータ&quot; - 詳細下記）の特定の特性を測定することにより、検出の処理が促進される。このようにサイトごとに、一つは、&quot;比率のしきい値&quot;と&quot;セルのエッジのしきい値&#39;減算のしきい値&quot;を計算します。 <ol><li>プラグインの[メニュー]&gt;マクロ&gt;のインストール... ...と&quot;JNCT0.08Release.ijm&quot;を選択します。 </li><li>プラグインの[メニュー]&gt;マクロ&gt;負荷スタック（ショートカット：L）。シリーズを選択して、パーティクルのパラメータを計算します。 <ol style="list-style:none;"><li> A.減算のためのしきい値（=バックグラウンド） </li></ol></li><li>あなたが&quot;背景&quot;であると信じるもの以上の矩形ROIを選択してください。 </li><li>尺度（ショートカット：M）。平均値ダウンに注意してください。 <ol style="list-style:none;"><li> B.比率の計算しきい値</li></ol></li><li>長方形を選択します。セル（複数可）の光学的に平坦な領域の周りROI。 </li><li>尺度（ショートカット：M）。平均値と標準偏差を書き留めます。 </li><li>さらに2回繰り返し、ORは&quot;シフト&quot;を押して一度に3つのボックスを描画することができます。 </li><li> 3 /のサイトを複製するから値を平均し、=（1 + SD /平均値）× 32の比率のしきい値を計算し、書き留めておきます。 <ol style="list-style:none"><li> C.セル端のしきい値</li></ol></li><li>画像&gt;スタック&gt; Zプロジェクト...投影タイプを選択します：&quot;平均強度を&quot; </li><li>画像&gt;&gt;しきい値を調整します。 </li><li>黒と白]を選択します。 </li><li> &quot;下&quot;の定義（上側のスライダ）を制限すると、対応する値（スライダーの右側にある）を書き留めておきます。黒の領域で発生するイベントだけがカウントされます。 </li><li> &quot;リセット&quot;をクリックします。 </li><li>スタックを分析（ショートカット：2） </li><li>この段階で一つのシリーズを選択し、&#39;最初のファイルを&quot;IEと&#39;最後のファイルは、&quot;同じでなければなりません。 </li><li> 、&quot;比率のしきい値&quot;と&quot;セルのエッジのしきい値&#39;を減算するためのしきい値&quot;の値を入力します。それらのデフォルト値で他の設定のまま。 </li><li>このアルゴリズムは、処理系が左側に示されているデュアルペインのウィンドウと右上の元を生成します。慎重に目で見えるイベントは、、検出されていないもので偽陽性と機会の数を評価するためにこの通過。 Ca 2 +のより正確な検出+トランジェントを得るためにそれは少し&quot;粒子のパラメータ&quot;のいくつかを調整する必要があります。プロセスは少し&quot;ヒットとミス&quot;を思わ最初の試みでもありますが、人はすぐにパラメータが鍵となるものとして感じを取得します。 </li><li>各シリーズの場合、アルゴリズムは、Excelファイルを生成することを検出したイベントの詳細特性（振幅、面積や位置など）。 &quot;偽陽性&quot; - このExcelファイルから、手で、削除される可能性がある - アルゴリズムの出力は（例えばステップ8.17）という画像ファイルを確認して識別される。 </li></ol>

<ol>
	<li>Haugland, R. P., Gregory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indicators+for+Ca2+,+Mg2+,+Zn2++and+other+metal+ions.">Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions.</a> Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).</li><li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+force+and+Ca2++in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse.">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li><li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder.">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li><li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+purinergic+Ca2++transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle.">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li><li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2++transients+in+mouse+vas+deferens.">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li><li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases.">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li><li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder.">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li><li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks.">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li></ol>

努力が使用される動物の数とそれらの苦しみを最小限に抑えるためになされた、すべての実験は、英国の動物（科学的手続）法、1986年と欧州共同体理事会指令86/09/EECに準拠して実施した。

蛍光のCa 2 +指示薬の選択 （ⅱ）のCa 2の生理的変化に敏感である+濃度、それは（i）は他の指標（例えばみたFluo - 4、カルシウムグリーン）1に比べて明るいですので、オレゴングリーン488 BAPTA - 1 AMは、Ca 2 +指示薬として選ば ​​れました（ⅲ）負荷、多くの平滑筋細胞、監視されるカップリング平滑筋細胞を可能にする;に細胞内Ca 2 +濃度[Ca 2 +] iの（VASの例は、2精）同じような大きさ1のK dでしかし、オレゴングリーン488 BAPTA - 1 AMは非ratioableのCa 2 +指示薬である、そのように簡単に絶対的に決定するために使用することができます[Ca 2 +] iの。さらに、それはまた+が存在する場合、高濃度でのCa 2のバッファおよび[Ca 2 +] iの高振幅の変化で飽和になる可能性があります。 自発的な収縮の阻害平滑筋臓器の自発的な収縮は、L型Ca 2 +チャネル（：;ジルチアゼム4ニフェジピン3によってなど）を通してのCa 2 +の動きをブロックすることとして、薬理学的に減少させることができる。これらの薬物は非常に全細胞のCa 2の振幅+点滅/放電時間を短くすることに注意してください。 VASの収縮は主にプリン作動性とノルアドレナリン性神経伝達の組み合わせから結果を精。この組織の焦点のCa 2 +過渡は、しかしながら、ノルアドレナリン受容体遮断（例えば、α1アドレナリン受容体、プラゾシン5による）の動きが焦点のCa 2 +過渡電流に影響を与えずに低減することができるようにすると小文字が区別されません。 また、収縮がワートマニン6によりミオシン軽鎖キナーゼなどの阻害を介して&quot;下流&quot;を防止することができる。 結論サブミクロン分解能でのCa 2 +蛍光を監視することで神経伝達物質放出5,7の後の接合効果を研究し、Ca 2 +の放出+内部 ​​貯蔵（例えば&#39;火花&#39;8）からする強力な手法です。のCa 2 +過渡解析ここで概説する方法論を使用しては、費用対効果であり、市販の画像解析のパッケージと比較すると、ImageJ用のカスタム記述のJavaプラグインを通じて、カスタムメイドの分析を行うことができます。

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O6807</td>
<td>10 x 50 &mu;g</td>
</tr>
<tr>
<td>Pluronic F-127 solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>20% solution in DMSO</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica SP2 upright confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Air table (&#x2018;vibration isolated workstation&#x2019;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Newport</td>
<td>M-VW-3046-OPT-012140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 elastomer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

focal ca2+ transient detection in smooth muscle

の Ca 2 は、平滑筋の+イメージングは、内部貯蔵からの Ca 2 +の放出のような膜電位の変化、という結果に可能性細胞メカニズムへの洞察を提供し、同時に監視する複数の細胞は、例えば、評価することができます、のカップリング合胞体組織。細胞内のCa 2 +過渡電流は平滑筋では一般的ですが、まだ契約にそれが発生しやすい、その臓器で、ビューの多くの場合幅広い分野にわたって、原因確率論的な発生に起因する問題の正確な測定が困難である。この問題を克服するために、我々は、自動化された形で、そのような事象の頻度、位置と振幅を取得し、解析するイメージングプロトコルと分析の一連のルーチンを開発しました。このアプローチは他のコンテキストに適用されるかもしれないが、私たち自身の仕事は、ローカルプリンのCa 2の検出+サブミクロンの分解能で伝達物質の放出を検索するための過渡状態を含む。 ATPは、それが排尿筋と輸精管の平滑筋上のP2X1受容体に結合する自律神経、から共存伝達物質として放出される。 のCa 2 +プリン神経効果器のCa 2 +過渡（NCTS）で、その結果、平滑筋に入ります。焦点のCa 2 +過渡電気生理学よりも多くの利点を持っている方法で、神経伝達物質の放出の光学的モニタリングを可能にする。離れて大幅に向上空間分解能から、光記録は、同時に多くの識別可能なサイトからの伝達物質の放出の記録を可能にするという利点もあります。さらに、焦点の光学面は維持または細胞内鋭い微小電極の再配置よりも長時間録音のシリーズの間に修正する方が簡単です。 要約すると、 カルシウムのイメージング+蛍光のための方法が概説されている細部組織の準備、およびデータの収集と分析。我々は、例えばCa 2 +過渡電流の解析のためのいくつかのスクリプトの使用を概説する。

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Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

高解像度のCaの詳細方法<sup&gt; 2 +</supを含む分離された臓器、内平滑筋の&gt;イメージング：組織、画像取得とデータ解析の準備。

焦点のCa 2 +</sup平滑筋の>過渡検出

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

focal-ca2-transient-detection-in-smooth-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

11.2K ビュー.  University of Oxford. 高解像度のCaの詳細方法 2 +イメージング：組織、画像取得とデータ解析の準備。

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Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

ヒト臍帯動脈平滑筋細胞の単離（HUASMC）

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

生物学

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

パッチクランプ電気生理学および圧力筋運動記録法を用いた動脈平滑筋KV7カリウムチャネル機能を探る

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

新生児マウスから肺動脈平滑筋細胞の単離

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

薬理研究に単離された組織のバース·アプリケーションにおける平滑筋機能の測定

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

細胞内カルシウムの二光子イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;取扱い及び内皮における一酸化窒素産生および単離されたラット大動脈の平滑筋細胞

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

マウス冠動脈血管平滑筋細胞の単離

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

ネズミ大動脈挫傷：効率的<em&gt;インビボ</em&gt;平滑筋細胞の増殖と内皮機​​能のモデル

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

クリック化学を用いた血管平滑筋細胞の増殖測定

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in the aorta and regulates vasoconstriction and vasodilation. Mutations in genes encoding for the SMC contractile apparatus proteins are associated with aortic diseases, such as thoracic aortic aneurysms. Measuring SMC contraction in vitro is challenging, especially in a high-throughput manner, which is essential for screening patient material. Currently available methods are not suitable for this purpose. This paper presents a novel method based on electric cell-substrate impedance sensing (ECIS). First, an explant protocol is described to isolate patient-specific human primary SMCs from aortic biopsies and patient-specific human primary dermal fibroblasts for the study of aortic aneurysms. Next, a detailed description of a new contraction method is given to measure the contractile response of these cells, including the subsequent analysis and suggestion for comparing different groups. This method can be used to study the contraction of adherent cells in the context of translational (cardiovascular) studies and patient and drug screening studies.

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

This paper describes an explant culture-based method for the isolation and culturing of primary, patient-specific human aortic smooth muscle cells and dermal fibroblasts. Furthermore, a novel method is presented for measuring cell contraction and subsequent analysis, which can be used to study patient-specific differences in these cells.

原発性患者特異的大動脈平滑筋細胞の単離とインビトロでの半定量的リアルタイム収縮測定

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...

焦点のCa 2 +過渡検出

焦点のCa^{2 +過渡検出}