ルンドベック財団オーフス大学、Dandrite、ルンドベック A/S は、この仕事を支えた。

注: 特に明記しない限り、室温ですべての手順を実行、冷蔵庫 (を除いて溶出からバッファーの SDS を含む)、氷の上にバッファーを維持します。プロトコルは 5 つのセクションに分けられる: 準備の RNA サンプルです。ip アドレスのビーズの準備ビーズ; に BrU 標識 RNA の結合溶出と 3 ステップ フェノール フェノール/クロロホルム クロロホルム抽出によってバインドされている BrU 標識 RNA の浄化(この例は Rt-qpcr を使用) で RNA の解析
1. RNA サンプルの準備
<ol><li>自動セルを用いたカウント HEK293T 細胞カウンターし、の合計を取得する 10 mL 成長媒体 (10% 牛胎児血清と 50 μ G/ml ペニシリン/ストレプトマイシン ダルベッコ変更イーグル培地添加) で 10 cm シャーレで細胞を 3,500,000 の種子 > 40 μ g RNA時に後で 48 時間の抽出。37 ° C と 5% の CO2の細胞を維持します。</li>
	<li>播種後 48 h 8 mL 成長媒体を吸引し、細胞を乾燥を避けるために 2 mL を残し。2 mM BrU を追加し、8 mL に任意の治療は成長媒体を吸気し 8 mL BrU 含んでいる成長媒体を再適用する前にセルから残留 2 mL を削除します。これは遺伝子発現の変化を誘発することができますので、BrU のセルへの適用時に新鮮なメディアの使用を避けてください。</li>
	<li>BrU と治療 1 時間細胞を孵化させなさい。5 mL ハンクのバッファー内セルを洗浄し、2 mL 0.05% トリプシンを使用してセルを trypsinize します。反応を停止し、15 mL チューブにセルを転送 1,000 x g で 2 分間細胞スピンダウン 8 mL 成長媒体を追加します。</li>
	<li>上澄みを除去し、RNA の隔離を使用して細胞ペレットからの総 RNA の抽出キット (材料の表を参照してください) またはその他ご希望の方法と RNase フリー H2o. ストアで続行する準備ができるまで-80 ° C で RNA を溶出します。</li>
</ol>2. ビーズの IP のための準備
<ol><li>ピペッティング時に損失を考慮し、混合旋回余分なプラス 1 調査するサンプルの数をバッチでビーズを準備します。抗マウス IgG 磁気ビーズ渦混合することによって徹底的に再懸濁します、RNase フリーの 1.5 mL チューブのサンプルあたりの 20 μ L ビーズを取り出してください。場所マグネット スタンド、ビーズのまま約 20 秒で 1.5 mL チューブ側を収集します。</li>
	<li>上澄みを除去、マグネット スタンドからチューブを取り出し、ピペッティングで 400 μ L 1 x BrU IP バッファーで再懸濁します。2 の非常に簡単にチューブを回転テーブル トップ遠心分離機で s マグネット スタンドに戻ってそれを置くし、上清を除去。洗浄工程をもう一度繰り返します。</li>
	<li>ヘパリンを使用してビーズに非特異的結合をブロック。1 mL 1 のビードを再停止しなさい x BrU-IP + 1 mg/mL ヘパリン バッファー、および回転 30 分洗浄用ビーズ、一度手順 2.2 のように残す。 注: ヘパリンは、バインディングの Rna と競合負荷電ポリマーです。下流のアプリケーションをシーケンス処理がない場合、tRNA または他の無関係な Rna を使用もできます。</li>
	<li>1 mL 1 x BrU IP バッファーのビードを再停止しなさい、BrU も認識し、1.25 の μ g/サンプル反-α-ブロモデオキシウリジン抗体を追加します。1 h のビーズを回転させながらインキュベートまたは室温で一晩します。</li>
	<li>3 回ステップ 2.2 のようにビーズを洗浄します。1 mM BrU と残す回転ビーズに、ここの抗体の感度を下げることで 30 分間 IP 中に不明確な結合のリスク補完 50 μ L/サンプル 1 x BrU IP バッファーのビードを再懸濁します。</li>
	<li>3 回ステップ 2.2 のようにビーズを洗浄し、50 μ L/サンプル 1xBrU IP バッファーで再懸濁します。</li>
</ol>3. ビーズに BrU 標識 RNA の結合
<ol><li>手順 1.3 からの RNA 抽出の RNA 濃度を測定紫外可視吸光光度法を使用し、希釈 40 μ g RNA 各サンプルから無料の RNase H2O で 200 μ L の総ボリュームに。</li>
	<li>RNA と卓上遠心分離機で簡単にスピンを変性する 80 ° C で 2 分間の RNA のサンプルを加熱します。BrU-IP + BSA/RNAse 阻害剤 x 200 μ L 2 を追加します。</li>
	<li>50 μ L 再停止される各サンプルにステップ 2.6 からビーズを準備し、1 h. 洗浄 4 回ステップ 2.2 のようにビーズを回転のままを追加します。</li>
</ol>4. 溶出と 3 段階フェノール フェノール/クロロホルム クロロホルム抽出法による RNA の精製
<ol><li>
RNA を溶出し、フェノールの抽出を実行
	<ol>
<li>溶出が RNA、200 μ L の溶出バッファーでビードを再停止しなさいし、すぐにその後 200 μ L フェノール、pH 6.6 を追加 (注意: 有毒を参照してくださいステップ 4.1.2 下注) 任意の非 RNA 分子をサンプルから削除します。</li>
		<li>旋回ミックス サンプルとスピン卓上遠心分離機で 25,000 x g で 3 分。 注: フェノールは毒性があり皮膚の保護を身に着けているヒューム フードで処理する必要があります。わずかに酸性 pH のみ RNA およびない DNA が抽出されることが保証されます。RNA は、料金の親水性の性質上水相に残ります。蛋白質の疎水性コアはフェノールをバインドし、低い有機フェノール相に移動します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
フェノール-クロロホルム抽出を行う
	<ol>
<li>(200 μ l の処理での経験によって、約 190 μ L) を可能な限り相を吸引し、200 μ L フェノール/クロロホルム、pH 6.6 管に移動 (注意: 有毒なメモを参照してください)。サンプル間で同じ量を吸引することを確認します。</li>
		<li>旋回は、サンプルと 25,000 x g で 3 分のスピンを混ぜます。 注: クロロホルムは毒性があり皮膚の保護を身に着けているヒューム フードで処理する必要があります。クロロホルムは、フェノールは、逆のトランスクリプション14およびポリメラーゼの連鎖反応のための15を阻害することによって RNA の下流の分析に影響を与えることができますを削除する追加されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>として水性上部の段階 (現在約 180 μ L) 前に、の吸引によってクロロホルム抽出を行なうし、200 μ L のクロロホルムを含む管に転送します。サンプルをミックスを試して、スピン 25,000 x g で 3 分。</li>
	<li>吸引として水性上部の段階 (現在約 170 μ L) の前に、17 μ L (1/10 巻) 3 M CH3COONa、pH 6.0 を含む管に転送。中和し、水溶液から RNA を沈殿させる、2 μ L グリコーゲン (20 mg/mL)、一緒に RNA の沈殿物と RNA の餌をより見えるようになりますを追加します。</li>
	<li>何度かチューブを反転で塩イオンと RNA とミックス間のバインディングの向上に 500 μ L 96% エタノールを追加します。ドライアイスに-20 ° C または 15 分で一晩管を残します。</li>
	<li>25,000 x g、ペレットを乱すことがなく 30 分破棄上清の 4 ° C でサンプルをスピンし、餌を残留塩分を落 185 μ L 75% エタノールで洗浄します。25,000 × g、4 ° C、5 分で回転します。</li>
	<li>ペレットを乱すことがなく完全に上澄みを廃棄し、オープンふた付け 5-10 分を乾燥するペレットを残します。10 μ L で RNase フリー H2O はペレットを脅かさないようチューブの側面に適用を再懸濁します。</li>
</ol>RNA の解析
<ol><li>CDNA の逆のトランスクリプションを使用して cDNA を準備キット (材料の表を参照してください) またはその他の優先 2 μ L の RNA のサンプルと用いた 1 μ g 酵母総 RNA RNA のキャリアとして cDNA 合成反応 (次世代シーケンシングの cDNA を使用する場合は使用しません)。対応する入力の cDNA 作製に 1 μ g RNA 酵母 RNA なしを使用します。</li>
	<li>希薄 cDNA 1:25 とミックス 9 μ L 希釈 cDNA 10 μ L の qPCR のマスター ミックスと 1 μ L 蛍光プローブ両方テーブルの材料に指定されています。 注: cDNA 希釈は cDNA の調製と qPCR 法使用に依存します。</li>
	<li>(例えば、 7500 の高速リアルタイム PCR システムまたはそれと同等の) 次の qPCR のプログラムを実行する: 50 ° C、20 で 2 分 95 ° C、3 の 40 のサイクルで s 95 ° C、30 秒 60 ° C で s</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kofoed, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-like+kinase+2+modulates+&#945;-synuclein+protein+levels+by+regulating+its+mRNA+production.">Polo-like kinase 2 modulates &#945;-synuclein protein levels by regulating its mRNA production.</a> Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).</li><li>Imamachi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRIC-seq:+A+genome-wide+approach+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells.">BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells.</a> Methods. 67, 55-63 (2014).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li><li>Lee, T. I., Young, R. 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Disord. 29, 1476-1485 (2014).</li><li>Magdalan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Amanitin+induced+apoptosis+in+primary+cultured+dog+hepatocytes.">alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes.</a> Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).</li><li>Lu, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actinomycin+D+inhibits+cell+proliferations+and+promotes+apoptosis+in+osteosarcoma+cells.">Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells.</a> Int. J. Clin. Exp. 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A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications.">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).</li><li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+inhibitors+-+occurrence,+properties+and+removal.">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).</li><li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA.">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67, 45-54 (2014).</li><li>D&#246;lken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> Rna. , 1959-1972 (2008).</li><li>Raghavan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+decay+in+resting+and+activated+primary+human+T+lymphocytes.">Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes.</a> Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).</li><li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells.">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Res. 16, 45-58 (2009).</li><li>Pandya-Jones, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+kinetics+and+transcript+release+from+the+chromatin+compartment+limit+the+rate+of+Lipid+A-induced+gene+expression.">Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression.</a> RNA. 19, 811-827 (2013).</li></ol>

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このプロトコルでは、新しくのラベルによって RNA の生産の決定は bru さんは、続いてすぐの RNA の抽出、BrU 標識 RNA の免疫沈降で 1 h の RNA を生産のための BrU IP の使用について説明します。このメソッドは、以前の参照16に記載されているし、この記事にフェノール クロロホルムの精製ステップと同様に、BrU の低濃度の事前治療ビーズで IP 特異性と RNA の純度の向上にいく...

5-Bromouridine (BrU) 免疫沈降 (IP) なしで細胞における RNA 生成の研究または短い期間1,2をラベルの中に非常に限られた影響の細胞生理学。メソッドは、標識 RNA 抗体抗 BrU (図 1) を使用しての ip アドレスで新たに合成された RNA に BrU 続いて合成ウリジン誘導体の定款に基づいています。
何十年もそのタンパク質合成の転写調節することができますと転写因子の存在が 50 年以上も前に仮説を立てたが知られている3。今日では、いくつかの病気が転写、RNA の安定性の制御不全によって引き起こされる知られている (参考資料4の補足図 S1) と RNA の生産の変化を測定する能力が理解病で非常に重要なは開発。
その一方で、RNA の生産を調節するツールは少なすぎる、またはあまりにも多くのタンパク質発現やパーキンソン病 (PD) のように蛋白質の蓄積によって引き起こされる疾患の治療の新たな可能性を提供します。PD で、不溶性凝集体を蓄積優勢なタンパク質は α-シヌクレインと、α-シヌクレインのレベルは α-シヌクレイン遺伝子の遺伝子増殖は家族性 PD5を原因として病気に直結します。さらに、α シヌクレインを濃度依存的に集計します。Α-シヌクレインの mRNA のレベルのダウンレギュレーションしたがって PD 齧歯動物モデル6,7で神経細胞の損失を減少する RNA 干渉を使用して正常に達成されている興味深い治療方針です。
疾患や治療上の介在によって引き起こされる RNA の生産の変化を測定することができることが重要です。最新式の方法などの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (RT qPCR)、続いて逆のトランスクリプション RNA の定常状態レベルを測定が転写することによって変化を区別できないために変更RNA の安定性。RNA 減衰率の調査のため広く使用されている方法は、α-アマニチンや腐敗の Rna の測定に続いてアクチノマイシン D などの化合物を用いた転写マシナリーのブロックされています。ただし、誘導アポトーシス8,9などの細胞における転写の全体的な閉塞に関連するいくつかの問題があります。細胞毒素の効果の横にある転写阻害剤はまた α-アマニチンの遅い細胞内取り込みとアクチノマイシン D (参考10見直し) の特異性の欠如など、いくつかの技術的な問題を示します。
転写の全体的な閉塞を避けるためには、ヌクレオチド類似体、使用されている 5-エチニル ウリジン (5 EU)、4-thiouridine (4-TU)、BrU など。哺乳類細胞によってとられ、新たに合成された RNA は、特定の時間枠の内で RNA のパルス ・ ラベリングを有効にするのに組み込まれて、これらが容易に。BrU は 5 EU と 4-TU より毒性の少ない選択11,12の最寄りのアナログです。
BrU IP は、RNA 合成と安定率を調査し、従って総 RNA の変化の根本的な原因を区別する使用ことができます。この記事は、RNA 合成の測定に焦点を当てるし、参考2 RNA の安定性の調査の詳細についてを参照します。RNA 合成を調べるためには、細胞が簡単に付け BrU例えばBrU IP1 (図 1) に続いて 1 時間。これにより、ラベリング短期間内で合成された RNA の測定、観察された変化は RT qPCR による総 RNA の変化を測定することによってよりも RNA 合成の規則のより良い推定値を与えます。特筆すべきは、しかし、にもかかわらず、ラベリングの時間は、たとえば、のみ 1 h まだ劣化が観察される RNA レベルに影響を及ぼすに持つことができます。
BrU IP 実験からの RNA は、RT qPCR1または次世代シーケンス2,13によって下流の分析に適しています。北にしみが付くことやリボヌクレアーゼの保護試金など、その他の標準の RNA 検出方法は、特定の Rna の適用もあります。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ribolock Rnase inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11202D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Bromodeoxyuridine mouse antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Ultraviolet-visible spectrophotometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-Saturated Phenol pH 6.6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pure RNA isolation Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4444557</td>
			<td>qPCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman RNA probes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1</td>
			<td>Flurogenic probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR system</td>
			<td colspan="2">Applied Biosystems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xBrU-IP Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2xBrU-IP buffer supplemented with 1 &#956;g/&#956;L BSA and 80 U/mL Ribolock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrU-IP+ 1 mg/mL heparin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1xBrU-IP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 &#956;g/&#956;L BSA and 20 U/mL Ribolock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% SDS in RNAse-free H2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of rna synthesis using 5-bromouridine labelling and immunoprecipitation

定常 RNA レベルは 2 つの条件間にくらべると、変更は生産や RNA の分解の変化によって引き起こされるかどうかを区別することはないです。このプロトコルでは、RNA の生産、5 Bromouridine は短い期間 (例えば、1 h) 内で合成された RNA の調査を可能にする免疫沈降に続いて RNA のラベルを使用しての測定法について説明します。Α-アマニチンやアクチノマイシン D などの有毒の転写阻害剤の使用上の 5 Bromouridine ラベルと免役沈降法の利点があるないまたは非常に低い短期的な使用中に細胞生存率に及ぼす。しかし、5-Bromouridine-免疫沈降のみ RNA として急速に低下の他に、ラベリング短期間以内に生産、ゆっくりと生成をキャプチャするため RNA はこの方法で測定することは困難することができます。5-Bromouridine-免疫沈降によってキャプチャされた 5 Bromouridine 標識 RNA は、逆のトランスクリプション、量的なポリメラーゼの連鎖反応、次世代シーケンシングして分析できます。RNA のすべてのタイプを調べることができ、メソッドでこの例に記載されている mRNA の測定に制限はありません。

AsPC 1 セルの BrU ラベル時間の私たちの最初のテストを行った。セルは 0、1、2、および 4.5 h、続いて総 RNA の抽出、BrU IP の BrU と扱われました。GAS5 GAPDH BrU IP RNA は、1 h のラベルがそれぞれ GAPDH の GAS5、背景 (0 h) と比較して約 9 〜 と 44 倍変化を到達するのに十分に測定しました。
BrU IP と上記分析は、変更が発見された場?...

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Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

このメソッドは、RNA 合成を測定する使用することができます。5 Bromouridine は、セルに追加され、合成された RNA に組み込みます。RNA 合成は、5 Bromouridine ターゲット免疫沈降標識 RNA と逆のトランスクリプションおよび量的なポリメラーゼの連鎖反応による解析に続いて、ラベルの直後に RNA の抽出によって測定されます。

5 Bromouridine ラベルと免役沈降法を用いた RNA 合成の検討

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

investigation-rna-synthesis-using-5-bromouridine-labelling

Research

JoVE Journal

Genetics

9.4K ビュー.  Aarhus University. このメソッドは、RNA 合成を測定する使用することができます。5 Bromouridine は、セルに追加され、合成された RNA に組み込みます。RNA 合成は、5 Bromouridine ターゲット免疫沈降標識 RNA と逆のトランスクリプションおよび量的なポリメラーゼの連鎖反応による解析に続いて、ラベルの直後に RNA の抽出によって測定されます。

ビデオ: Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

角膜上皮創傷治癒中の熱ショックタンパク質27の機能のRNA干渉ベースの調査

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

遺伝学

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

マウスの褐色脂肪組織のクロマチン免疫沈降

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

ランデムにおけるRNA免疫沈殿によるRNAタンパク質複合体の足跡の同定、シーケンシング(RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite coupling reactions with the precision and density of UV light reflected from micrometer-sized mirrors. Photolithography yields microarrays that can accommodate from hundreds of thousands up to several million different DNA sequences, 100-nt or longer, in only a few hours. With this very large sequence space, microarrays are ideal platforms for exploring the mechanisms of nucleic acid&#183;ligand interactions, which are particularly relevant in the case of RNA. We recently reported on the preparation of a new set of RNA phosphoramidites compatible with in situ photolithography and which were subsequently used to grow RNA oligonucleotides, homopolymers as well as mixed-base sequences. Here, we illustrate in detail the process of RNA microarray fabrication, from the experimental design, to instrumental setup, array synthesis, deprotection and final hybridization assay using a template 25mer sequence containing all four bases as an example. In parallel, we go beyond hybridization-based experiments and exploit microarray photolithography as an inexpensive gateway to complex nucleic acid libraries. To do so, high-density DNA microarrays are fabricated on a base-sensitive monomer that allows the DNA to be conveniently cleaved and retrieved after synthesis and deprotection. The fabrication protocol is optimized so as to limit the number of synthetic errors and to that effect, a layer of &#946;-carotene solution is introduced to absorb UV photons that may otherwise reflect back onto the synthesis substrates. We describe in a step-by-step manner the complete process of library preparation, from design to cleavage and quantification.

In this article, we present and discuss new developments in the synthesis and applications of nucleic acid microarrays fabricated in situ. Specifically, we show how the protocols for DNA synthesis can be extended to RNA and how microarrays can be used to create retrievable nucleic acid libraries.

高密度DNAおよびRNAマイクロアレイ - 光リソグラフィー合成、ハイブリダイゼーション、大型核酸ライブラリーの調製

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...