この方法は、潜在的な細胞質タウ汚染を除いた一方で、核コンパートメントにおけるタウの直接的な役割に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、他の細胞型および異なる細胞条件下におけるタウの核機能に関する研究に広く適用可能である。手順を実証することは、私の研究室のポストドクターであるジャコモ・シアーノです。
空のコントロールベクターにトランスフェクトされる5つのSH-SY5Yヒト神経芽細胞細胞に10回、タグなしタウでトランスフェクトされる5つの細胞に10回、タウNLSでトランスフェクトされる5つの細胞に4回10回、タウ-NESをトランスフェクトする5つの細胞に4回10回、5つの細胞に4回10を3つのウェルプレートの個々のウェルウェルにトランスフェクトする。めっきの翌日、400ナノグラムのDNAと適切な量のカチオン脂質を1つのチューブに分けて、1ウェルあたり250マイクロリットルの減少した血清をインキュベートする。室温で5分後、各ベクターを1体積のカチオン脂質と組み合わせ、室温で20分間DNA脂質複合体をインキュベートします。
インキュベーションの終わりに、各ウェルの上清を2ミリリットルの新鮮な完全な培養培地に置き換え、摂氏37度で一晩インキュベーションするための適切なDNA脂質複合体溶液でそれぞれをうまくトランスフェクトする。翌日、上清を新鮮な分化培地に置き換えます。ウェスタンブロット分析では、各井戸のトランスフェクトおよび分化した細胞をPBSで洗浄し、摂氏37度で4分間、1ウェルあたり0.1%トリプシンの500マイクロリットルで細胞をインキュベートします。
細胞が剥離したら、完全な培地の等量で反応を停止し、遠心分離のために各ウェルから個々のチューブに細胞懸濁液を移す。上清を慎重に除去した後、2番目の遠心分離のためにチューブあたりPBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、再び上清を除去する。全タンパク質抽出物の場合、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加したリシスバッファーの50〜100マイクロリットルで氷上で30分間ペレットをインキュベートします。
インキュベーションの終了時に、抽出物を16,000回gで15分間遠心分離し、任意の標準的な定量アッセイによってタンパク質濃度を定量する。その後、各タンパク質サンプルの20マイクログラムを4Xレムリバッファーの5マイクロリットルと混合し、合計容量20マイクロリットルにし、サンプルを摂氏100度で5分間沸騰させます。細胞内分画の場合は、カウント用の完全な培地中の細胞を再懸濁し、サンプルあたり6個の細胞に10回スピンダウンします。
細胞質分画を分離するには、10分間穏やかな混合で摂氏4度のプロテアーゼ阻害剤を添加した氷冷細胞質抽出バッファーの100マイクロリットルでペレットをインキュベートする。インキュベーションの終了時に、遠心分離によってサンプルを収集し、上清を冷やされたチューブに移します。100マイクロリットルの氷冷膜抽出バッファーをペレットに加え、穏やかな混合で摂氏4度で10分間インキュベーションします。
その後、ペレットを摂氏4度と3,000倍gで5分間遠心し、上清を新しいチューブに集めます。可溶性核分率を収集するには、プロテアーゼ阻害剤を添加した核抽出バッファーの50マイクロリットルを渦液でペレットに加え、サンプルを摂氏4度で30分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、サンプルを遠心分離し、上清を収集します。
不溶性核分率を収集するには、プロテアーゼ阻害剤、塩化カルシウムおよびミクロコッカルヌクレアーゼをボルテックスでペレットに添加した核抽出バッファーの50マイクロリットルを加えます。渦と遠心分離機の前に摂氏37度で5分間サンプルをインキュベートします。その後、上清を収集します。
細胞骨格分画を収集するには、50マイクロリットルの細胞骨格抽出バッファーを加え、プロテアーゼ阻害剤を添加し、渦を伴うペレットに添加します。室温で10分間のインキュベーションの後、サンプルを遠心分離し、上清を収集します。SDS-PAGE分析では、収集した細胞内分率サンプルのそれぞれ20マイクロリットルに4Xレムリバッファーの7マイクロリットルを加え、サンプルを摂氏100度で5分間沸騰させます。
インキュベーションの最後に、サンプルをアクリルアミドゲルにロードし、120ボルトの一定電圧で電気泳動を行います。その後、タンパク質をニトロセルロース膜に250ミリアンペアで90分間移します。ポンソー染色液で膜を5分間インキュベートし、適切なタンパク質ゲル電気泳動とブロットが成功していることを確認します。
インキュベーションの終わりに、バックグラウンドがきれいになるまで蒸留水で膜をすすい、シェイカーで10分間Tween 20を補ったトリス緩衝生理食液で連続洗浄して汚れを取り除きます。次に、トリスバッファー生理食糸と Tween 20 を洗浄ごとに 5 分間洗浄する前に、振盪で室温で 1 時間ブロック溶液で膜をインキュベートします。最後の洗浄後、摂氏4度で一晩ブロッキング溶液に関心のある一次抗体で膜をハイブリダイズし、続いてトリス緩衝生理食肉とTween 20を5分間洗浄します。
最後の洗浄後、トリス緩衝生理食肉とTween 20を洗浄1回5分間3回洗浄する前に、ブロック溶液中の適切な西洋ワサビペルオキシダーゼを常温で1時間、ブロッキング溶液に組み合わせて膜をハイブリダイズします。最後の洗浄後、化学発光を用いてタンパク質バンドを検出し、ImageJでウェスタンブロットバンドの強度を定量化します。レチノイン酸および脳由来神経栄養因子がない場合、未分化SH-SY5Y細胞は、丸い形態を仮定し、細胞塊を形成する。
予想通り、レチノイン酸による5日間の治療の後、塊は解き戻され、細胞は広がった。脳由来神経栄養因子による3日間の治療の後、細胞は分岐した神経突起のネットワークを介して均一に分布し、相互接続されて現れる。タウ-NLSまたはタウ-ファミコントランスフェクション後、タウ細胞内局在化は、抗タウ抗体による免疫蛍光によって検出することができる。
トランスフェクションの効率に応じて、細胞はタウ-NLSトランスフェクション後のDAPIシグナルと結合する強い核染色を示すか、タウ-ファミコン後の空核で細胞質染色を行う。ウェスタンブロット分析は、細胞骨格分画内のアクチン、細胞質および細胞骨格分画内の管状管、および核画分内のH2Bの濃縮を明らかにする。ウエスタンブロット分析はまた、全抽出物中の核コンパートメントおよびベシカルグルタミン酸トランスポーター内のタグ付きおよびタグなしタウの発現を確認する。
実際、可溶性核および細胞質画分におけるタウの比率は、タウ-NLSが可溶性核分率に高く富化され、タウ-NESが減少するという事実を強調している。さらに、タウ-NLSは、タウ-ファミコンが減少している間、細胞質画分に関してクロマチン結合画分で濃縮される。各サンプルの分画に使用される細胞の数を注意深くチェックし、適切な分数でハウスキーピング遺伝子の濃縮を確認してください。
このビデオを見た後, 細胞コンパートメントを分離し、核のタウの機能的役割を評価することができるはずです.
