Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über die direkte Rolle von Tau im Kernraum zu beantworten und gleichzeitig eine mögliche zytoplasmatische Taukontamination auszuschließen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Großen und Ganzen auf die Untersuchung der Kernfunktion von Tau in anderen Zelltypen und unter verschiedenen zellulären Bedingungen anwendbar ist. Demonstriert wird das Verfahren von Giacomo Siano, einem Post-Doc aus meinem Labor.
Beginnen Sie mit der Beschichtung viermal 10 zu den fünf SH-SY5Y menschlichen Neuroblastom-Zelllinienzellen, die mit dem leeren Kontrollvektor transfiziert werden sollen, viermal 10 bis zu den fünf Zellen, die mit nicht markiertem Tau transfiziert werden sollen, viermal 10 zu den fünf Zellen, die mit Tau-NLS transfiziert werden sollen, und viermal 10 auf die fünf Zellen, die mit Tau-NES in einzelne Bohrungen transfiziert werden sollen. Am Tag nach der Beschichtung tauchen 400 Nanogramm DNA und das entsprechende Volumen kationischer Lipide separat in eine Röhre mit 250 Mikroliter reduziertem Serum pro Brunnen ein. Kombinieren Sie nach fünf Minuten bei Raumtemperatur jeden Vektor mit einem Volumen kationischen Lipids und inkubieren Sie die DNA-Lipidkomplexe 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Am Ende der Inkubation die Überräube in jedem Brunnen durch zwei Milliliter frisches Gesamtkulturmedium ersetzen und jeden Brunnen durch die entsprechende DNA-Lipid-Komplexlösung für eine nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius transfezieren. Am nächsten Tag die Überstande durch frisches Differenzierungsmedium ersetzen. Für die Western Blot-Analyse die transfizierten und differenzierten Zellen in jedem Brunnen mit PBS waschen und die Zellen mit 500 Mikrolitern 0,1%Trypsin pro Brunnen vier Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Wenn sich die Zellen gelöst haben, stoppen Sie die Reaktion mit einem gleichen Volumen des vollständigen Mediums und übertragen Sie die Zellsuspension von jedem Brunnen in einzelne Rohre für die Zentrifugation. Nach sorgfältigem Entfernen der Überräube die Pellets in einem Milliliter PBS pro Rohr für eine zweite Zentrifugation wieder aufsetzen und die Überräube wieder entfernen. Für Proteinextrakte insgesamt die Pellets 30 Minuten lang auf Eis in 50 bis 100 Mikroliter Lysepuffer eintauchen, ergänzt durch Protease- und Phosphatase-Inhibitoren.
Zentrifugieren Sie den Extrakt am Ende der Inkubation 15 Minuten lang bei 16.000 mal g und quantifizieren Die Proteinkonzentration durch einen Standard-Quantifizierungstest. Dann mischen Sie 20 Mikrogramm jeder Proteinprobe mit fünf Mikrolitern 4X Laemmli Puffer auf ein Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern und kochen Sie die Proben bei 100 Grad Celsius für fünf Minuten. Für die subzelluläre Fraktionierung, setzen Sie die Zellen in vollständigem Medium für das Zählen und Drehen Sie ein mal 10 zu den sechs Zellen pro Probe.
Um die zytosolische Fraktion zu isolieren, inkubieren Sie die Pellets in 100 Mikroliter eiskalten zytoplasmatischen Extraktionspuffer mit Protease-Inhibitoren bei vier Grad Celsius mit sanfter Mischung für 10 Minuten ergänzt. Am Ende der Inkubation die Proben per Zentrifugation sammeln und die Überräube in vorgekühlte Schläuche übertragen. Fügen Sie 100 Mikroliter eiskalten Membranextraktionspuffer mit Protease-Inhibitoren in das Pellet für eine 10-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius mit sanftem Mischen.
Dann zentrifugieren Sie die Pellets für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und 3.000 Mal g und sammeln Sie die Überräube in neue Schläuche. Um die lösliche Kernfraktion zu sammeln, fügen Sie 50 Mikroliter Kernextraktionspuffer, ergänzt mit Protease-Inhibitoren, zu den Pellets mit Wirbeln hinzu, bevor Sie die Proben 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubieren. Zentrifugieren Sie am Ende der Inkubation die Proben und sammeln Sie die Überstande.
Um die unlösliche Kernfraktion zu sammeln, fügen Sie 50 Mikroliter Kernextraktionspuffer hinzu, ergänzt durch Proteasehemmer, Calciumchlorid und Mikrokokkennuclease zu den Pellets mit Wirbeln. Inkubieren Sie die Proben für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius vor Wirbeln und Zentrifugieren. Dann sammeln Sie die Überstand.
Um die Zytoskelettfraktion zu sammeln, fügen Sie 50 Mikroliter Zytoskelettextraktionspuffer hinzu, der mit Proteasehemmern ergänzt wird, zu den Pellets mit Wirbeln. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur zentrieren Sie die Proben und sammeln Sie die Überräube. Für die SDS-PAGE-Analyse fügen Sie sieben Mikroliter 4X Laemmli Puffer zu 20 Mikrolitern jeder der gesammelten subzellulären Fraktionsproben hinzu und kochen die Proben fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius.
Am Ende der Inkubation die Proben auf ein Acrylamidgel laden und die Elektrophorese bei einer konstanten Spannung von 120 Volt durchführen. Dann die Proteine mit 250 Milliampere für 90 Minuten auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Inkubieren Sie die Membran für fünf Minuten in Ponceau Färbelösung, um auf die richtige Protein-Gel-Elektrophorese und eine erfolgreiche Blotting zu überprüfen.
Am Ende der Inkubation die Membran in destilliertem Wasser abspülen, bis der Hintergrund sauber ist, und entfernen Sie den Fleck mit kontinuierlicher Wäsche mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, ergänzt mit Tween 20 für 10 Minuten auf einem Shaker. Als nächstes inkubieren Sie die Membran mit Blockierlösung für eine Stunde bei Raumtemperatur mit Schütteln, bevor Sie dreimal mit Tris-gepufferter Salin plus Tween 20 für fünf Minuten pro Wäsche waschen. Nach der letzten Wäsche hybridisieren Sie die Membran mit dem primären Antikörper von Interesse an der Blockierlösung über Nacht bei vier Grad Celsius, gefolgt von drei Wäschen mit Tris-gepufferter Salin plus Tween 20 für fünf Minuten.
Nach der letzten Wäsche die Membran mit einem geeigneten Meerrettichperoxidase konjugierten Sekundärantikörper in Blockierlösung für eine Stunde bei Raumtemperatur hybridisieren, bevor Sie die Membran mit Tris-gepufferter Salin plus Tween 20 dreimal für fünf Minuten pro Wäsche waschen. Nach der letzten Wäsche, erkennen Sie das Proteinband mit Chemilumineszenz und quantifizieren Sie die Intensität der Western Blot Bänder von ImageJ. In Ermangelung von Retinsäure und neurotrophen Faktor aus dem Gehirn nehmen undifferenzierte SH-SY5Y-Zellen eine rundere Morphologie an und bilden Zellklumpen.
Wie erwartet, nach fünf Tagen der Behandlung mit Retinsäure, die Klumpen sich abziehen und die Zellen sich ausbreiten. Nach drei weiteren Behandlungstagen mit neurotrophen Faktoren des Gehirns erscheinen die Zellen gleichmäßig verteilt und über ein Netzwerk verzweigter Neuriten miteinander verbunden. Nach Tau-NLS- oder Tau-NES-Transfektion kann die subzelluläre Lokalisation durch Immunfluoreszenz mit Anti-Tau-Antikörpern nachgewiesen werden.
Je nach Effizienz der Transfektion zeigen die Zellen eine starke kerntechnische Färbung, die mit dem DAPI-Signal nach Tau-NLS-Transfektion oder einer zytoplasmatischen Färbung mit den leeren Kernen nach Tau-NES verschmilzt. Die Western Blot-Analyse zeigt die Anreicherung von Actin innerhalb der Zytoskelettfraktion, Tubulin innerhalb der zytoplasmischen und zytoskelettalen Fraktionen und H2B innerhalb der Kernfraktionen. Die Western Blot-Analyse bestätigt auch die Expression von markierten und nicht markierten Tau innerhalb des Kernraums und des vesikulären Glutamattransporters einen Ausdruck im Gesamtextrakt.
Tatsächlich unterstreicht das Verhältnis von Tau in den löslichen Kern- und Zytoplasmafraktionen die Tatsache, dass Tau-NLS in der löslichen Kernfraktion stark angereichert ist, während Tau-NES verringert wird. Darüber hinaus wird Tau-NLS in der chromatingebundenen Fraktion in Bezug auf die zytoplasmatische Fraktion angereichert, während Tau-NES verringert wird. Achten Sie darauf, die Anzahl der Zellen, die für die Fraktionierung jeder Probe verwendet werden, sorgfältig zu überprüfen und die Anreicherung der Haushaltsgene in den richtigen Fraktionen zu überprüfen.
Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie in der Lage sein, Zellfächer zu isolieren und die funktionelle Rolle von Tau im Kern zu bewerten.
