Bu yöntem, herhangi bir potansiyel sitoplazmik tau kontaminasyonhariç nükleer bölmede tau doğrudan rolü hakkında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, tau'nun diğer hücre tiplerinde ve farklı hücresel koşullarda nükleer işlevi üzerine yapılan çalışmaya geniş ölçüde uygulanabilir olmasıdır. Prosedürü gösteren Giacomo Siano, benim laboratuvar bir post-doc olacaktır.
Dört kez 10 beş SH-SY5Y insan nöroblastom hücre hücreleri için kaplama ile başlayın boş kontrol vektörü ile transfected olmak, dört kez 10 beş hücre etiketsiz tau ile transfected olmak, dört kez 10 beş hücre tau-NLS ile transfected olmak, ve dört kez 10 beş hücre ye göre tau-NES ile altı plaka-iyi bir tabak bireysel kuyularına transfected olmak. Kaplamadan bir gün sonra, ayrı ayrı 400 nanogram DNA ve katyonik lipidlerin uygun hacmini her kuyuda 250 mikrolitre azaltılmış serumdan oluşan bir tüpe kuluçkaya yatırın. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, katyonik lipid her vektör ü bir hacim birleştirmek ve oda sıcaklığında 20 dakika DNA lipid kompleksleri kuluçka.
Kuluçka sonunda, her kuyudaki süpernatantları iki mililitre taze tam kültür ortamıile değiştirin ve her kuyuda 37 santigrat derecede bir gecede kuluçka için uygun DNA lipid kompleksi solüsyonu ile transfect. Ertesi gün, supernatants taze farklılaşma ortamı ile değiştirin. Batı Blot analizi için, her kuyudaki transfected ve farklılaşmış hücreleri PBS ile yıkayın ve hücreleri 500 mikrolitre 0,1 Tripsin ile kuluçkaya yatırın ve hücreleri 37 santigrat derecede dört dakika boyunca iyi başına %0,1 Tripsin'e dönüştürün.
Hücreler ayrıldığında, tam orta eşit hacimli reaksiyonu durdurmak ve santrifüj için ayrı tüpler içine her kuyudan hücre süspansiyon aktarın. Supernatants dikkatlice çıkardıktan sonra, ikinci bir santrifüj için tüp başına PBS bir mililitre pelet yeniden askıya ve tekrar supernatants kaldırın. Toplam protein ekstreleri için, proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile takviye lisis tampon 50 ila 100 mikrolitre buz üzerinde 30 dakika pelet kuluçka.
Kuluçka sonunda, 16, 000 kez g 15 dakika için ekstresi santrifüj ve herhangi bir standart niceleme testi ile protein konsantrasyonu ölçmek. Daha sonra her protein numunesinin 20 mikrogramını 5 mikrolitre 4X Laemmli tampon ile 20 mikrolitrelik bir hacimle karıştırın ve numuneleri 100 derecede beş dakika kaynatın. Hücre altı fraksiyonu için, sayma için tam ortamda hücreleri yeniden askıya ve örnek başına altı hücre için bir kez 10 aşağı spin.
Sitozolik fraksiyonu izole etmek için, 10 dakika boyunca nazik karıştırma ile dört derece santigrat proteaz inhibitörleri ile takviye buz soğuk sitoplazmik ekstraksiyon tampon 100 mikrolitre pelet kuluçka. Kuluçka sonunda, santrifüj ile örnekleri toplamak ve önceden soğutulmuş tüpler içine supernatants aktarın. Hafif karıştırma ile dört derece santigrat bir 10 dakikalık kuluçka için pelet proteaz inhibitörleri ile desteklenen buz soğuk membran ekstraksiyon tampon 100 mikrolitre ekleyin.
Sonra dört santigrat derece ve 3, 000 kez g beş dakika için pelet santrifüj ve yeni tüpler içine supernatants toplamak. Çözünür nükleer fraksiyonu toplamak için, 30 dakika boyunca dört derece santigrat örnekleri kuluçkadan önce girdap ile girdap ile pelet proteaz inhibitörleri ile desteklenen nükleer ekstraksiyon tampon 50 mikrolitre ekleyin. Kuluçka sonunda, örnekleri santrifüj ve supernatants toplamak.
Çözünmez nükleer fraksiyonu toplamak için, girdap ile peletlere proteaz inhibitörleri, kalsiyum klorür ve mikrokokal nükleaz ile desteklenen nükleer ekstraksiyon tampon 50 mikrolitre ekleyin. Girdap ve santrifüj önce 37 santigrat derece beş dakika boyunca örnekleri kuluçka. Sonra supernatants toplamak.
Sitosiskelet fraksiyonu toplamak için, girdap ile peletprote inhibitörleri ile desteklenen sitoskeletal ekstraksiyon tampon 50 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçkadan sonra, numuneleri santrifüj edin ve süpernatantları toplayın. SDS-PAGE analizi için, toplanan hücre altı fraksiyon örneklerinin her birine 20 mikrolitre 4X Laemmli tampon yedi mikrolitre ekleyin ve beş dakika boyunca 100 santigrat derecede örnekleri kaynatın.
Kuluçka sonunda, örnekleri akrilamid jelüzerine yükleyin ve elektroforezi 120 voltluk sabit bir voltajda gerçekleştirin. Daha sonra proteinleri 250 miliamperde 90 dakika nitroselüloz membrana aktarın. Uygun protein jelelektroforezve başarılı bir lekelenme kontrol etmek için Ponceau boyama çözeltisi beş dakika boyunca membran kuluçka.
Kuluçka sonunda, arka plan temiz olana kadar damıtılmış suda membran durulayın ve tris-tamponlu salin ile sürekli yıkama ile leke kaldırmak 20 Bir shaker üzerinde 10 dakika Ara ile takviye. Daha sonra, tris-tamponlu salin artı Tween 20 yıkama başına beş dakika yıkama ile üç kez yıkamadan önce sallayarak oda sıcaklığında bir saat boyunca engelleme çözeltisi ile membran kuluçka. Son yıkamadan sonra, dört derece santigrat de bir gecede çözüm engelleme ilgi birincil antikor ile membran hibrid tris-tamponlu tuzlu artı Tween 20 ile üç yıkama takip beş dakika.
Son yıkamadan sonra, tris-tamponlu tuzlu artı Tween ile membran yıkama başına beş dakika için 20 üç kez yıkamadan önce oda sıcaklığında bir saat boyunca engelleme çözeltisi uygun bir horseradish peroksidaz konjuge ikincil antikor ile membran hibridize. Son yıkamadan sonra, kemilüminesans kullanarak protein bandını tespit edin ve ImageJ ile Western Blot bantlarının yoğunluğunu ölçün. Retinoik asit ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör yokluğunda, farklılaşmamış SH-SY5Y hücreleri yuvarlak morfolojisi varsayar ve hücre kümeleri oluştururlar.
Beklendiği gibi, retinoik asit ile tedavi beş gün sonra, kümeleri gevşemek ve hücreler yayıldı. Beyin kaynaklı nörotrofik faktör ile tedavi üç ek gün sonra, hücreler düzgün dağıtılmış ve dallı nöritler bir ağ üzerinden birbirine görünür. Tau-NLS veya tau-NES transfeksiyonundan sonra, tau subsellüler lokalizasyonu anti-tau antikorları ile immünoresans ile saptanabilir.
Transfeksiyonun etkinliğine bağlı olarak, hücreler tau-NLS transfeksiyonu veya tau-NES sonrası boş çekirdeklerle sitoplazmik boyama sonrasında DAPI sinyali ile birleşen güçlü bir nükleer boyama görüntüler. Batı Blot analizi sitoskelet fraksiyonu içinde aktin zenginleştirme ortaya koymaktadır, sitoplazmik ve sitoskeletal fraksiyonları içinde tubulin, ve h2B nükleer fraksiyonları içinde. Batı Blot analizi de toplam ekstresi ve veziküler glutamat taşıyıcı içinde etiketli ve etiketsiz tau ifadesini doğrular.
Gerçekten de, çözünür nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlarda tau oranı tau-NLS yüksek çözünür nükleer fraksiyonu zenginleştirilmiş ise tau-NES azalmıştır gerçeğini vurgulamaktadır. Ayrıca, tau-NLS sitoplazmik fraksiyona göre kromatin bağlı fraksiyonu zenginleştirilmiş ise tau-NES azalır. Her numunenin fraksiyonu için kullanılan hücre sayısını dikkatlice kontrol ettiğinizden ve uygun kesirlerde temizlik genlerinin zenginleştirmesini doğruladığından emin olun.
Bu videoyu izledikten sonra, hücresel bölmeleri izole etmek ve çekirdek tau fonksiyonel rolünü değerlendirmek gerekir.
