髄膜炎は、世界中の人間の集団の間で敗血症と髄膜炎の最も一般的な原因の一つであり、細菌は人間の宿主に制限されています。本実験プロトコルでは、細菌の内分化を基にしたマウスモデルにおける髄膜炎菌性髄膜炎の誘導に関する調整された手順について説明する。このマウスモデルは、髄膜炎菌性髄膜炎の特徴的な病理学的事象を重篤なヒト疾患として再現した。
したがって、宿主と病原体の相互作用を評価し、この致死性疾患を引き起す病態メカニズムを分析するのに有用なツールを表す。この感染モデルは、細菌がCSFに直接複製されるのを防ぐ革新的な治療戦略を評価するだけでなく、ヒト病原体に対する受動的免疫療法の有効性を分析するのにも役立つ可能性がある。この技術は、内在性接種だけでなく、一般的に病気の誘導の成功を保証するために訓練段階を必要とします。
手順を実証するには、研究者としてロベルタ・コリッキオとキアラ・パリウカ、博士課程の学生としてエレナ・スカリオーネが私の研究室で行われます。まず、1%ポリビトックスサプリメントを補充したゴノコッカス寒天プレートの新鮮なナイセリア髄膜炎培養から単一のコロニーを選び、10ミリリットルGCブロスで接種する。メニンゴコッチの使用を含むすべての手順は、層流バイオ安全キューブキャビネットの下で行われなければなりません。
220 RPMで軌道振れインキュベーターで37°Cで細菌を成長させ、分光光度計で異なる時点で培養物の光学密度をチェックし続けます。初期指数相に対応する 0.7 の OD600 に達するまで培養を拡大します。この光学濃度が得られたら、10%グリセロールを加え、クライオバイアルに1ミリリットルの培養液を分配して冷凍ストックを作ります。
使用するまでバイアルを摂氏80度で保管してください。感染前に、凍結細菌を室温で解凍し、1500xGで15分間遠心分離機の遠心管に移し、上澄み物を取り除き、1キログラムの鉄デキスキンあたり5ミリグラムを含む新鮮なGCブロスの1ミリリットルで再中断する。実験を開始する前に、動物の体重を量り、体温を評価します。
動物を首からスカッフし、70%エタノールで腹部を消毒する。感染の約2時間前に、25ゲージ針を用いて、腹部の右下象限に腹腔内に鉄デキストランを注入する。動物を麻酔した後、つまみ時の痛みの反応がないことを確認して麻酔の深さを確認します。
層流キャビネットにマウスを置いた後、胸骨デキュビタスに位置し、椎骨柱をまっすぐな位置に保つために手足と頸椎を慎重に伸ばします。一貫した細菌懸濁液を維持するために、8ミリメートル30ゲージ針で注射器にロードする前に、そっと混ぜます。70%エタノールで頭部を消毒する。
動物を横方向の不屈の位置に置き、耳を引っ張り出し、首を適度に曲げる。首と頭部の正線がテーブルトップと完全に平行な位置にあることを確認します。次に、アトラスの翼に触れ、それらが重なっていることを確認し、針が後頭部の穴に入る可能性が最も高い正中線の自然なくぼみを感じます。
メニンゴコッチまたは鉄デキストラン補充GC Brothの確立された亜致死性細菌量を10マイクロリットルの総体積で制御して、8ミリメートル30ゲージ針で注射器を充填します。注射ポイントを識別するために針を使用し、後頭部バリ穴を通してマウスの水槽マグナに注射器の含有量を注入します。注射後、注射器と針を安全に捨てます。
動物を層流キャビネットの下のケージに入れます。運動の目覚めと完全な回復を待ち、プロトコルに記載されているように、感染した動物の動物の生存のために進みます。マウスを麻酔した後、70%エタノールで胸部を消毒する。
25ゲージ針を使用して、胸腔の心臓穿刺によって600〜700マイクロリットルの血液を引き出す。3.8%のクエン酸ナトリウムを含むチューブに血液を採取し、後で実行可能な細菌細胞数評価のために摂氏80度で保存します。安楽死させたマウスを仰向けの位置に置きます。
はさみと鉗子を使って、体の矢状平面に沿って毛皮を切る。ピンで、体の側面に毛皮で皮膚を固定します。鋭利なはさみを使って腹膜を切り落とします。
次に、はさみと使い捨ての鉗子で、脾臓や肝臓などの器官を切除し、1ミリリットルのGCブロスを10%グリセロールで補った別々の滅菌ペトリ皿に入れます。5ミリメートルのシリンジのプランジャーを使用して、単一細胞懸濁液が形成されるまで室温で機械的に2〜3分間均質化し、硬化性のクライオバイアルに移す。ドライアイスの上にチューブを置きます。
抗生物質でGC寒天プレートを作り、2〜3時間摂氏37度で使用する前に乾燥させます。各均質化組織からGC Brothでサンプルの10完全な連続希釈液を調製する。GC寒天プレートにプレートを入れ、5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベートします。
70%エタノールで、安楽死させたマウスの頭部を消毒する。小さな外科用ハサミと細かい先端のスチール鉗子を使用して、毛皮と取り除かれた頭部の皮膚を切除し、縫合糸をはっきりと見て頭蓋骨の開口部を導くために頭蓋骨の上部に向かって進みます。頭蓋骨を開くには、頭蓋マグナムを通して小さなはさみの先端を挿入します。
頭蓋骨の反対側に頭蓋骨の中心に向かってカットし、羊の縫合糸の側面に沿って穏やかにカットします。細かい筋力を使って、後頭頂部から始めて、頭蓋骨を持ち上げて斜めに上に引っ張って脳を発見し、頭蓋骨が持ち上げられたときに脳組織が頭の骨に付着していないことを確認する。使い捨て鉗子を使用して、頭蓋骨と脳の間の結合組織を取り除き、脳組織を乾燥させないでください。
使い捨て鉗子を使用して、10%グリセロールを補充したGCブロスの1ミリリットルのペトリ皿に脳をすぐに置きます。5ミリリットルシリンジのプランジャーを使用して、単一細胞懸濁液が形成されるまで、室温で機械的に2〜3分間均質化します。懸濁液を2ミリリットルの無菌チューブに移し、80°Cで保存し、後で実行可能な細菌細胞数評価を行います。
93/4286野生型またはcssA欠陥ナイセリア髄膜炎株に感染したマウスの生存率を評価した。野生型株の致死量の中央値は、10から4番目のCFUの髄膜炎菌チャレンジに対応した。死亡率10から5番目のCFUは83.4%と100%に等しかったのに対し、5回目のCFU用量は10%であった。
cssA欠損変異株に対する致死量の中央値を得るためには、10〜8番目のCFUの用量が必要であり、量は野生型株よりも1000倍高かった。注射後、感染後約24時間でピークに達する脳組織中の野生型細菌の急激な増加があった。突然変異株に感染したマウスの脳では、生存可能な数は時間の経過とともに徐々に減少した。
また、変異型感染マウスの33.3%は、野生型感染動物とは異なり、感染部位からの細菌クリアランスを示した。感染の48時間後、sA欠損変異体は脾臓および肝臓で完全にクリアされ、一方、野生型株に感染した動物は持続的な感染を示した。この実験方法は、免疫組織化学、免疫蛍光、脳出血解析などの病理的評価によって、この致死性疾患に関連する脳損傷を分析するのに有用であり得る。
