著者は、原稿の重要な読書のためのDumenilラボのすべてのメンバー、特にジルケ·シルバに感謝したいと思います。マホソットヨーロジョルジュ·ポンピドゥー（HEGP）での手術部門、デビッドMaladry。マイケルHivelin博士パトリックBruneval、HEGPの病理部。エリザベスユック率いるPARCCの動物施設、。この作品は、次のgrant機関によってサポートされていました：マリー·キュリーのIEFの交わりがない。 273223（KM）、INSERMからATIP-アベニールグラントは、CODDIM機器の助成金（イル=ド=フランス地方）、FRM機器の助成金、優秀コンソーシアムのIBEID研究所（財団はLA RECHERCHEmédicaleを注ぐ）、ANR助成金」（通信社国立ラ·ルシェルシュを注ぐ）バグ·イン·フロー」。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備に何の役割がありませんでした。

1。リスクと権限<ol><li> 地元の倫理委員会は、すべての動物のプロトコルを承認する必要があります。このプロトコルは、フランスやヨーロッパの実験動物の管理と使用に関する規制（Décrets87から848、2001から464、2001から486及び2001から131とによって確立されたガイドラインに基づいて実施された欧州指令2010/63/UE）とローカル倫理委員化委員会D&#39;ETHIQUEエンマチエールD&#39;実験ANIMALE、大学パリデカルト 、パリ、フランスで承認した。いいえ：CEEA34.GD.002.11ん。 </li><li>人間の肌のために、書面による通知を患者の同意を得て、すべての手順は、フランス国のガイドラインに従って実施し、地域の倫理委員会、 化委員会D&#39;評価ETHIQUEドゥINSERM IRB 00003888 FWA 00005881、パリ、フランス世論によって承認された：11から048 。 </li><li> 髄膜炎菌は、潜在的に有害な人間の病原体であるとORGAを取り扱う際に必要なすべての予防措置が取られなければならないNISM。これらの注意事項は、ワクチン接種が含まれており、バイオセーフティレベル2の条件の下で働く。 </li></ol> 2。皮膚移植<ol><li>できるだけ時間をグラフトに近い人間の皮膚を収集します。本研究では、皮膚の大部分は、腹部領域に関連する整形手術操作から来ている。乳房、脚、さらには顔の他のソースは、成功を収めて使用されている。 </li><li>好ましい流フードの下で、70％エタノールで皮膚表面を洗浄し、十分に洗浄された表面上に平らに横たわっによりヒト皮膚のサンプルを準備します。 </li><li>プリセット厚さの皮膚分節を用いて皮膚の上から200〜400程度のスライスをスライス。 </li><li>短期保存のための10％血清（3-12時間で、すぐにまたはDMEM中で4℃、グラフト化する場合には整合性のために、皮膚のスライスを確認し、2センチメートル×2センチメートルの正方形に切ると、（二価の陽イオンを含まない）PBS中に置く）。 </li><li>ケタミン（100 mg / kgの）およびキシラジン（10 mg / kg）の麟蹄で6〜8週齢のSCID.bgマウス（約20g）を麻酔しCTED IP </li><li>マウスを麻酔した後、つま先のピンチ、痛みの反射を確立するための標準的な方法を実行することによって、疼痛反応をチェック。角膜の乾燥を防ぎ、移植片が配置される肩の後ろに動物の左側を剃ることを目にゲルを適用します。作業中はヒートパッド上でマウスを暖かく保つ。 </li><li>手術のためにマウスを準備中した後、70％EtOHで剃毛エリアを清掃してください。 </li><li>移植部位（Tronothane）に局所局所麻酔を適用し、慎重に湾曲したハサミでマウスの皮膚の表層を除去することにより、移植部位を準備します。基礎となる血管系を破壊しないように注意してください。 </li><li>人間の皮膚切片の面積より少し小さい面積で皮膚を取り除きます。 </li><li> PBS（またはDMEM）から肌のスライスを削除し、移植床の上に置いて、表皮側が上を向いている保証されます。ステップ2.8から2.10に移植床が乾燥しない確実に、可能な限り迅速に行うべきである。 </li><li> 1角を合わせまたはEDGEおよび組織接着剤で固定します。慎重にエッジの周りに組織接着剤の少量を配置し、移植床に皮膚スライスの残りに合う。いつものサイズに、ヒトの皮膚をトリミングではなく、移植床を大きくしてください。 </li><li>マウスの皮膚は非常に柔軟であるとして移植床の上にきつすぎる肌を引っ張らないでください。 </li><li>移植片は各コーナーにおける組織接着剤で固定されていることを確認します。 </li><li>ヨウ素溶液で領域をきれいにします。 </li><li>移植片の上にクッション面積でバンドエイドを適用します。バンドエイドが企業が、タイトではなく、動物の呼吸に影響を与えないことを確認してください。 </li><li>ドレッシングテープでバンドエイドを修正します。 </li><li>動物は暖かい表面に回復することができます。 </li><li>目を覚ましたら、そのケージに動物を返します。動物はケージ当たり2-3に収容されている。 </li><li>痛みや苦痛の徴候のための回復中に定期的にマウスを確認してください。 10〜14日、移植後、移植片を破壊しないように注意しながら、バンドエイドを削除します。我々の経験では、術後の痛みはミニですMAL。それにもかかわらず、動物は操作の後、数日、特に毎日監視する必要があります。痛みや苦痛の基準は以下の通りである。 <ul><li> 10パーセント以上の重量の損失</li><li>物理的な外観、毛皮、せむしの位置、目</li><li>増加呼吸や心臓の料金</li><li>減少または異常な動き。 </li><li>体温の上昇</li><li>場合、疼痛の兆候が検出されたparacetamoleが（300 mg / kgを、4時間毎）を経口投与する。痛みが続く場合は人道的なエンドポイントは厳密に接着されている。 </li></ul></li><li>移植片が乾燥して見える場合はしなやかな肌を保つために2〜3日ごとにベビーオイルを適用します。 </li><li>移植片は、実験21日後に移植のための準備ができています。 </li></ol> 3。感染<ol><li>感染の前日には、適切な抗生物質を含むGCB寒天プレート上にストリークした細菌株を準備します。 5％CO 2中で37℃で一晩増殖させる。 </li><li> 細菌の準備 <ol&gt; <li> OD 600は0.05〜10％血清を有するヒト内皮SFM培地5mlのにReinoculate細菌。 </li><li>緩い蓋をインキュベーターで2時間（37℃、5％のCO 2）振とうしながら、約OD 600 0.1の細菌密度まで、インキュベートする。 </li><li> 3分15,000 rpmで細菌を遠心分離する。 </li><li> PBS中の上清と再懸濁を削除し、再度遠心する。 </li><li>二回の洗浄ステップ（2.2.4-2.2.5）を繰り返します。 </li><li> PBSに細菌ペレットを再懸濁します。 </li><li> OD 600を測定します。 </li><li> OD 600 0.1（10 8 CFU / ml）のいずれかの培養物、またはOD 600 1.0（10 9 CFU / ml）を作る。この既知の濃度から、10 7 CFU / mlに希釈する。できるだけ噴射時間に近い細菌を準備してみてください。 </li></ol></li><li> マウス <ol><li>マウスを秤量する。 </li><li>ケタミン（100 mg / kg）を、およびキシラジンでマウスを麻酔し（10 mg / kg）を腹腔内注射</li><li>一度眠って、C一体その疼痛反応は、熱パッドで暖かくマウスを保ち、乾燥を防ぐために眼軟膏を入れ、つま先のピンチによっては存在しない。 </li><li>各マウスに食塩水またはPBSに再懸濁ヒトトランスフェリン8mgのを与える、腹腔内注射</li><li>尾からの血液の小滴を取り、血液が感染前に滅菌されているチェックする寒天プレート上に広げた。 </li><li>静脈内に後眼窩または尾静脈から100μlを10 7 CFU / mlの細菌培養（10 6 CFUの合計）を注入。 5分後に注射を取っCFUの測定値に関係なく、注射部位に一致している。 </li><li>数分後、尾の端を切り取ると、すぐに感染後の血中のCFUを確立するための1 10倍希釈して、適切な抗生物質を含む寒天プレート上に血液サンプルを広げた。 </li><li>組織接着剤で尾を封印。 </li><li>注入後、細菌接種を希釈し、CFUを確立するために、適切な抗生物質を含む寒天プレート上に広げた。 </li><li>マウスを許可する彼らが移動になるまでヒートパッド上で回復さ</li><li> 6時間感染後に、尾部から少量の血液を引き出す希釈し、6時間後にCFUを確立するためにプレート。 </li><li> CO 2で一晩5％で37℃で、すべての寒天プレートをインキュベートする。 </li></ol></li></ol> 4。犠牲<ol><li>感染の選択された時に、ケタミン（100 mg / kg）をおよびキシラジンでマウスを麻酔した（10mg / kg）を腹腔内注射</li><li>眠っていると、熱パッドでマウスを暖かく保つ。 </li><li>痛みの反射が（つま先のピンチを）行っているときは、尾の先端を切り取ると血を引く。 </li><li>適切な抗生物質を含む寒天プレート上に血液を広め、5μlの直接およびCFUを確立するために、10μlの1:10希釈。 </li><li>頚椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げる。 </li><li>すべての関連機関および倫理指針に従ってマウスを犠牲にした後に、ハートビートの欠如によって死亡が確認された。正中切開を行い、胸郭を切って、聞くに切開するT。 </li><li>滅菌チューブの心臓/胸腔と場所からできるだけ多くの血液を採取する。 </li><li>無菌プレートに臓器（ 例えば 、肝臓、脾臓、脳）を取り外します。 </li><li>無菌プレートに皮膚移植およびマウスの皮膚のセクションを削除します。 </li><li>マウス本体を処分。 </li><li>採取した血液を15分間凝固させされた後、3,000 rpmで15分間遠心分離して。 </li><li> ELISAまたはFACSベースの方法によるサイトカインの検出については、例えば、後の分析のために-80℃で、血液やストアから血漿を除去。 </li></ol> 5。臓器CFU計数<ol><li>各生検の前のサンプルを取ることに500μlのPBSを含む管を均質化量る。 </li><li>無菌の生検パンチを使用して各組織から4mmの生検サンプルを取る。 </li><li> 500μlのPBSを含む予め秤量均質化チューブに置いて生検。他の臓器には小さいビーズを使用し、2mmのビーズを用いて皮膚試料をホモジナイズする。 </li><li>残りのTを配置顕微鏡検査のために4℃で4％パラホルムアルデヒド（PFA）およびストア内の問題（以下参照）。 </li><li> （CFU / mgの組織のそれ以降の計算のために）生検の重量を確立するための生検を含むチューブを均質化量る。 </li><li>サンプルを均質化する。 <ol><li> 30秒間6,000 rpmで、肝臓、脾臓および脳を均質化する。 </li><li> 30秒間6,000 rpmで皮膚サンプルを均質化し、必要に応じて繰り返します。 </li></ol></li><li>寒天プレート上に各均質化チューブから希釈液を広げ、器官CFUカウントを確立するために、5％CO 2中で37℃で一晩増殖する。 </li></ol> 6。組織学/免疫組織化学<ol><li> 固定 <ol><li> 4℃で一晩4％PFA中の組織を修正しました。固定工程は長くなる場合があり、長期間保存するには、0.25％PFAで組織を配置した場合。 </li><li> PBSに組織を洗い流してから、20％ショ糖溶液中に置き、一晩または組織が溶液中に沈んするまで4℃に戻ります。 </li><li> （組織型の中で、またはベースボードに接着さのいずれか）のサイズと10月溶液中の場所にカットし、PBS中で組織を洗浄します。 </li><li>すぐに液体窒素中に浮遊するペトリ皿上で組織を凍結する。 </li><li>凍結後、保存のために-80℃に移す前に、ドライアイスの上に組織を置く。 </li></ol></li><li> スライシング <ol><li> -80°Cから組織を取り出して、クライオスタットに-20℃に平衡化させる。 </li><li>スライス約10〜15ミクロンの厚さの組織とは、コーティングされた顕微鏡スライド上に配置します。 </li><li>必要になるまでストアは-20℃でスライドさせる。 </li></ol></li><li> 染色 <ol><li>スライドを室温に戻します。 </li><li>疎水性のペンでスライド上のスライスを中心に描く。 5〜10分待ちます。 </li><li> 5分間PBS中/洗浄スライスを再水和、二回繰り返します。 </li><li> 10分間、PBS中0.1％トリトンにおける透過処理スライス。 </li><li> 5分間、PBS 2〜3倍に洗浄します。 </li><li> PBS中のブロック10〜60分の間で使用される抗体又は汚れに応じて0.1％トリトン1％BSA。 </li><li>ブロッキングバッファー外し、ブロックバッファに必要に応じて希釈した一次抗体を加える。決められた時間インキュベートする。 （多くの場合、室温で1時間、または一晩4℃）。 </li><li> 5分間、PBS 2〜3倍に洗浄します。 </li><li>ボックバッファ内の適切に希釈した二次抗体を適用し、DAPIは、一般的に、このステップに含まれています。暗闇の中で、決められた時間、多くの場合、1〜2時間室温でインキュベート。 </li><li> 5分間、PBS 2〜3倍に洗浄します。 </li><li>マニキュアでカバーガラスとシールで封入剤を保護するフェードインマウント。 </li><li> 4℃でのイメージ染色スライド直ちにまたはストア</li><li>使用蛍光団への適切なフィルター/レーザーを使用して設定または共焦点蛍光顕微鏡で撮影を行う。 </li></ol></li><li> 組織学 <ol><li>スライドを室温になるまで組織学のために使用することができます。 </li><li>として使用して染色スライドtandardヘマトキシリン​​/エオシン染色プロトコル。 <ol><li>スライドラックにスライドを置きます。 </li><li>次の順序でソリューション間のスライドラックを移す。 </li><li>水道水に2秒。 </li><li>フィルタリングヘマトキシリン​​溶液中で3分。 </li><li>流水に10秒。 </li><li>蒸留水に10秒。 </li><li>エタノール100パーセントに10秒。 </li><li>フィルタリングエオシンに2秒。 </li><li>流水に10秒。 </li><li>エタノール100パーセントに10秒</li><li>キシレン×3（バスI、II、III）に2分。 </li><li>すぐに転送して、各スライド上にトップの上に置いてカバースリップを固定接着剤を数滴を追加し、気泡を除去、数時間乾燥させます。 </li><li>画像は、標準的な白色光顕微鏡下でスライドする。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

動物モデルは、細菌の病原性の研究に非常に重要である。それは完全に細胞培養におけるin vivo環境を模倣することは不可能であり、それは、宿主-病原体相互作用は、多くの動的要因によって影響されることが明らかになってきている。このようなNのようないくつかの臨床的に重要な病原体の人間の特異性髄膜炎は 、HIV、HCV、 熱帯熱マラリア原虫、リステリア·モノサイトゲネス、及びチフス菌は、これらの感染症のためのin vivoモデルの使用が制限されている。我々は、感染ステップが、特異に関与しているかを理解し始めるように、しかし、ヒト化モデルが開発されている。ここで説明するプロトコルは、Nの生体内感染で豊富を考慮して、マウスへのヒト微小血管の導入に伴い、このデモで髄膜炎は 、血管損傷、時には紫斑発疹の開発をもたらし。 このモデルを用いて、我々のTfpの接着性細菌の変異体を使用し、血管損傷、接着18の非存在下で減少することが、インビボでの血管コロニー形成に関与していることを定義することができた。以前は、循環細菌産物は、この損傷に関与しているが、我々の結果は、地元密着性と血管コロニー形成のために決定的な役割を示唆している。これは新たな治療ターゲットの開発のための新しい可能性を開きます。病原性細菌の付着は、薬学的にブロックすることができれば、それはおそらく皮膚病変の発症を予防し、組織の壊死、壊死組織切除および切断の点で髄膜炎菌の生存者のためのより良い成果につながる可能性があります。仕事はまた、感染の複雑さと、免疫応答および凝固カスケードの関与を実証しています。我々は、本ヒト内皮18の比較的少量にもかかわらず、感染したマウスの血清中のヒトサイトカインシグナル伝達を同定した。これは、領域内にマウスの免疫細胞集団の浸透に伴って、有意なサイトカイン応答を示した。 動物モデルは、もちろん完全にヒトの疾患を複製することはできませんし、すべての結果はこのことを考慮して検討する必要があり、そこから集めました。例えば、このモデルでは、血液や循環細胞は、マウス由来のものであり、私たちは、彼らが人間の細胞に異なる挙動を示すことが軽視することはできません。この利点は、しかしながら、我々の最近の刊行物18に示されているように、循環するマウス細胞とは、ヒト内皮から発信シグナリング分化する能力である。このモデルで用いたマウスの免疫無防備状態のバックグラウンドは、さらに「ヒト化」局面を添加し、ヒト免疫細胞集団の同種転写を可能にするであろう。マウスの免疫不全の背景には、しかし、このすべてのモデルに欠けや不良NK、TまたはB細胞の役割をマスクすることができる。比較的ショアこのモデルで使用されるTの時間枠（24時間）は、主に生得的反応に関係しますが、長期的な感染症や免疫、その他のオプションの開発のために検討される必要があるかもしれない。 皮膚はNのための重要な感染部位である髄膜炎菌が、ヒトの血管の比較的少量を有し、また、多数の器官が関与する全身感染にデータを外挿することは困難であることを意味する。このモデルは、皮膚病変の開発の研究を可能にしながら、このような上皮および血液脳交差点などの髄膜炎菌感染症の重要なステップが含まれていません。これらのヒト化モデルのさらなる開発は、感染のこれらの他の側面に対処するために必要とされる。それにもかかわらず、このモデルでは、多数のヒトの特定の病原体、血管をターゲットに、特にそれらのための大きな可能性を提供しています。

髄膜炎菌性敗血症は、細菌性病原体、髄膜炎菌によって引き起こされ、頻繁に致命的な血液由来感染症です。以前に細菌や細菌産物1を循環させることによって引き起こされる血管の破壊に関連していた彼らの皮膚に点状出血や紫斑発疹と共に存在しばしば髄膜炎菌性敗血症患者。臨床患者から皮膚生検は、多くの場合、血管2を充填、微細血管に関連する細菌を示しています。離れて細菌から、広範な血栓症、凝固、渋滞や血管漏出はプルプルの地域3〜5に見られる。この血管の損傷は、髄膜炎菌の生存者でのデブリードマンおよび切断で、その結果、皮膚や周囲の組織の広範な壊死が引き起こされ得る。感染はこの血管損傷の原因とどのように理解することは、予防と治療戦略を最適化することが重要である。髄膜炎菌性敗血症の研究の大半は上のin vitroで行われているNの人間の特異性に起因するヒト細胞株髄膜炎菌 。感染の多くの側面は、細菌の接着、宿主細胞応答ならびにサイトカイン応答6-9を含むin vitroで研究されている。 IV型線毛（TFP）は、Nの主要な接着細胞小器官として関与している髄膜炎菌は、上皮細胞および内皮細胞の両方で10。またN.の付着が示されている宿主細胞への髄膜炎菌は、せん断応力に依存し、従って、微小血管11内の血流速度に関連すると考えられている。これは、細菌が生体内で直面する動的応力が病因に重要であるを示唆している。これは、 インビトロで小血管の微小環境をモデル化するが非常に困難である。 ナイセリア Tfpのための接着受容体はまだ不明であり、したがって、動物モデルにおける細菌の付着を達成するノックイン戦略は、現時点で想定することはできない。 CD46はTfpの受容体であることが示唆されたトランスジェニック動物は、マウスモデルとして作用するように作製した。しかし、これらの動物における感染は、大規模な感染につながるものではないか、開発12,13発疹する。 ナイセリア感染菌血症の態様に関して記載されている他の動物モデルは、鉄源14,15として考慮ヒトトランスフェリンのための細菌嗜好を取る。ヒトトランスフェリンを補充するか、長時間にわたって血流中の増加した細菌負荷における導入遺伝子の結果からそれを発現するが、このモデルは、細菌の接着または発疹現像16,17を示していないのいずれか。 このプロトコルでは、皮膚の微小血管系を含むヒトの皮膚は、免疫不全マウス18,19に移植されたヒト化マウスモデルを記載している。これは、マウスの循環で灌流機能性ヒト血管になる。ヒトトランスフェリン補充と組み合わせることで、このModelはN.ヒトの特定の側面の少なくとも二つを占める生体内環境における髄膜炎菌、すなわち 、ヒト内皮およびヒトトランスフェリン、。N.髄膜炎は 、血管損傷や紫斑発疹の開発18を含む臨床患者で報告されているものに似ている病理を生産する、人間の内皮に特異的に接着し、このモデルに静脈内に導入された。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="693">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">DMEM</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">31885-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10010-056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ketamine 500</td>
			<td style="width:161px;">Virbac France&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">LOT N&#176;VAL4243</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Xylazine</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Bayer Healthcare</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">AMM N&#176; FR/8146715 2/1980</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">LOT N&#176; KPO809S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">(Rompun 2%)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:247px;">Optigel&#160;&#160;&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Europhta</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">Medicament autoris&#233; N&#176;3400933521134</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Lacrigel&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tronothane</td>
			<td style="width:161px;">Lisa Pharma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:247px;">GC agar Base</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Conda</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">1106</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Human endothelium SFM media</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11111</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:161px;">P A A</td>
			<td style="width:119px;">A15-101</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Human transferrin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3309</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">UEA lectin - rhodamine</td>
			<td style="width:161px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">RL-1062</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9627</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Eosin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4009&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Xylene</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">534056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;">Humeca BV, Holland</td>
			<td style="width:119px;">4.SB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Equiptment Name</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sober Hand Dermatome</td>
			<td style="width:161px;">Humeca BV, Holland</td>
			<td style="width:119px;">4.SB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Animal housing</td>
			<td style="width:161px;">Innovive</td>
			<td style="width:119px;">M-BTM-C8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Biopsy punch (4 mm)</td>
			<td style="width:161px;">Dominic Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">30737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fast-Prep lysing matrix M tubes</td>
			<td style="width:161px;">MP Bio</td>
			<td style="width:119px;">116923050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MagNA Lyzer Green Beads</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3358941001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MagNA Lyzer</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3358976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vectashield mounting media</td>
			<td style="width:161px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vetbond</td>
			<td style="width:161px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1469SB</td>
			<td>Tissue Glue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">OCT tissue tek</td>
			<td style="width:161px;">Sakura</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature

髄膜炎菌は、ヒトの血流に入る重度の、しばしば致命的な敗血症を引き起こす。感染症は、血管漏出、紫斑発疹および最終的な組織壊死の発症をもたらす血管の甚大な被害をもたらす。この感染症の病因を研究する以前にin vivoモデルを困難にして細菌の人間の特異性によって制限されていました。このプロトコルでは、人間の皮膚、皮膚微小血管を含むが、免疫不全のマウスに移植されているこの感染ヒト化モデルについて説明します。それらのヒトの特徴を維持しながら、これらの血管は、マウスの循環に吻合。このモデルでは、Nに導入されると髄膜炎菌は、広範な血管損傷、炎症や紫斑発疹のいくつかのケースでは、開発中で、その結果、人間の血管に独占的に準拠しています。このプロトコルは、コンテでのこのモデルの移植、感染および評価の手順を説明しますNのXT 髄膜炎菌感染症。技術は、血流に感染する多数のヒト特異的病原体に適用することができる。

CFU計数 N.これらの代表的な結果で使用される髄膜炎菌株は、Nである。にOPC - - 、PilC1 + / PilC2 +20 膜炎 8013クローン12、血清群Cの臨床分離株では、私はSBピリン、オーパクラスを表現する。株は染色体挿入部18から緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するように操作されていた。細菌のコロニー形成単位数を寒天プレート上のコロニーの数を計数し、血液のCFU / mlまたはメッキ既知の容量からの組織のCFU / mgのいずれかを計算することによって確立される。血球数は、5分、10 6 CFUの細菌の静脈注射後に血液中を循環する1.5×10 5 CFU / mLの平均値（ 図1A）があったことを示した。 6時間後にカウントが4.8×10 4 CFU / mlの平均。 24時間別の平均数は、4 CFU / mlのX 10 2.4であったが、10匹のマウスのグループで、5は持っていた検出可能な他の5が比較的高いカウント（ 図1A）を持っていたが、細菌を循環させる。皮膚サンプルから取られたCFU計数は、6時間および24時間（ 図1B）での組織の4.4×10 2 CFU / mgである組織の2.1×10 4 CFU / mgの平均化、人間の皮膚にかなりの数を持つマウスの大部分を示している。反対マウス皮膚試料は、N.のための強い優先性を示す、24時間および6時間で非常に低い数でなく細菌数を示さなかった移植皮膚（ 図1B）における人間の血管への髄膜炎 。一般細菌数では2匹の動物は、彼らが高い循環細菌数（ 図1C）と相関したように、血液からの汚染に起因する可能性を示してカウントをしたが、サンプリングされた他の臓器で検出不能と非常に低かった。モデルはまた、IV型πを、例えば、 インビボでの病原性因子の役割を決定するために使用することができる李。提案Tfpの「付着因子」を欠いている細菌Tfpのを欠損株をもたらしpilD遺伝子 21において定義された変異を有する株だけでなく、pilC1遺伝子 8は 、モデルに導入した。これらの変異は、TFPは、生体内（ 図1D） での接着で再生されている重要な役割を確認し、ヒト皮膚移植片無し細菌の付着が生じた。 免疫組織化学/組織学これらの実験において、我々は、N.使用二次染色を必要とせずに蛍光検出を可能にするために緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する髄膜炎菌株 。ヒト血管は、ヒト内皮細胞のマーカーのいずれかを用いてCD31（PECAM-1）またはレクチンハリエニシダのハリエニシダ凝集素 （UEA）18,22を染色した。 UEAは、一工程染色（ 図2A-C）を可能ローダミンとコンジュゲートした。細胞核を染色することができますDAPIでEDは組織構造（ 図2A-B）を識別するのに役立つ。 組織学は、標準的なヘマトキシリン​​/エオシン染色を用いて行った。皮膚の表皮/真皮境界線は明確に識別した。炎症、血栓症および血管漏出は24時間感染（ 図2D）の後に、この国境に近い血管に濃縮した。血栓症は、多くの場合、渋滞や炎症を伴ういくつかの小さな皮膚血管に見えた。組織への赤血球の漏出うち血管損傷の広範なレベルを示す、見ることができた。非感染マウスでの移植皮膚の組織病 ​​理なしに区別炎症18で正常に見えた。感染の約30％において皮膚の細菌の付着は、肉眼で検出可能な紫斑病（ 図2Eおよび2F）の開発につながる。 <img alt="図1" fo:content-width=<html> SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg&quot; /&gt;：FO &quot;5インチ&quot; 図1。 CFUカウントされます。（A）5分、6時間、および24時間後の感染における血液のミリリットル当たりの細菌CFU計数。 （B）細菌CFU 6時間および24時間感染後の両方で、ヒト皮膚（HS）とマウス皮膚（MS）とを比較する皮膚試料からカウントする。 （C）細菌CFUを24時間後に感染を講じ、他の器官からカウントします。野生型N.に感染したマウスから24時間感染後に採取ヒトおよびマウスの皮膚サンプルからの細菌CFUカウントを比較すると（D） 髄膜炎菌 2C43染色（WT）、pilD遺伝子 （pilD）またはpilC1遺伝子 （pilC1）に変異を有する株に変異した株。すべてのグラフは、中央値で生データとして表示されます。図はMelican らから変更されている。18&quot;_blank&quot;&gt;拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2.jpg" /> 図2。真皮（D）表皮（E）の国境に近い、UEAレクチン（赤）で染色したヒト微小血管を示す共焦点スタックの顕微鏡。（A）は、投影。容器は、Nに感染している髄膜炎菌 （緑）2時間後に感染。 （B）の光のスライスとNを示すスライス投影（C） 髄膜炎菌の微小コロニー（緑）感染のヒト血管（UEA -赤）皮膚移植2時間後感染中。 N.で24時間感染させたヒト皮膚移植片の（D）ヘマ ​​トキシリン/エオシン染色髄膜炎菌 。表皮（e）は、真皮（D）の境界線がはっきりと見えると豊富な血栓症およびmicrovessの混雑ですELS（矢印）は、真皮に見られる。炎症およびいくつかの血管漏出（矢頭）も同定することができる。 （E）の感染前に人間の皮膚移植。 （F）Nの（E）の 24時間後に感染と同じ皮膚移植プルプル領域（矢印）を示す膜炎は、 図2（b）は、2D、2E、および2Fは Melican ら 18から変更されている図 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックし</a> 。

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Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

髄膜炎菌は、血管に感染するヒト特異的病原体である。このプロトコルでは、ヒト微小血管は、免疫不全マウスにヒト皮膚を移植することによってマウスに導入される。細菌は、典型的には、ヒトの場合に観察紫斑発疹の血管損傷と発展につながる、人間の血管に広く付着する。

微小血管系を対象に細菌感染を研究するためのヒト化マウスモデル

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

humanized-mouse-model-to-study-bacterial-infections-targeting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.7K ビュー.  Paris Cardiovascular Research Centre.  髄膜炎菌は、血管に感染するヒト特異的病原体である。このプロトコルでは、ヒト微小血管は、免疫不全マウスにヒト皮膚を移植することによってマウスに導入される。細菌は、典型的には、ヒトの場合に観察紫斑発疹の血管損傷と発展につながる、人間の血管に広く付着する。 

ビデオ: Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

マウスでイメージ細菌感染にルシフェラーゼを用いた

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

免疫・感染学

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Small animal models such as mice have been extensively used to study human disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of information gained from these studies, the unique characteristics of mouse immunity as well as the species specificity of viral diseases such as human immunodeficiency virus (HIV) infection led to the development of humanized mouse models. The earlier models involved the use of C. B 17 scid/scid mice and the transplantation of human fetal thymus and fetal liver termed thy/liv (SCID-hu) 1, 2 or the adoptive transfer of human peripheral blood leukocytes (SCID-huPBL) 3. Both models were mainly utilized for the study of HIV infection.
One of the main limitations of both of these models was the lack of stable reconstitution of human immune cells in the periphery to make them a more physiologically relevant model to study HIV disease. To this end, the BLT humanized mouse model was developed. BLT stands for bone marrow/liver/thymus. In this model, 6 to 8 week old NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) immunocompromised mice receive the thy/liv implant as in the SCID-hu mouse model only to be followed by a second human hematopoietic stem cell transplant 4. The advantage of this system is the full reconstitution of the human immune system in the periphery. This model has been used to study HIV infection and latency 5-8.
We have generated a modified version of this model in which we use genetically modified human hematopoietic stem cells (hHSC) to construct the thy/liv implant followed by injection of transduced autologous hHSC 7, 9. This approach results in the generation of genetically modified lineages. More importantly, we adapted this system to examine the potential of generating functional cytotoxic T cells (CTL) expressing a melanoma specific T cell receptor. Using this model we were able to assess the functionality of our transgenic CTL utilizing live positron emission tomography (PET) imaging to determine tumor regression (9).
The goal of this protocol is to describe the process of generating these transgenic mice and assessing in vivo efficacy using live PET imaging. As a note, since we use human tissues and lentiviral vectors, our facilities conform to CDC NIH guidelines for Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+). In addition, the NSG mice are severely immunocompromised thus, their housing and maintenance must conform to the highest health standards (<a href="http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html" target="_blank">http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html</a>).

The generation and characterization of tumor specific T cells using humanized mice is described here. Human thymic tissue and genetically modified human hematopoietic stem cells are transplanted into immunocompromised mice. This results in the reconstitution of an engineered human immune system allowing for in vivo examination of anti-tumor immune responses.

幹細胞ベースの遺伝子治療腫瘍モデルとしてBLTヒト化マウスを用いた

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

昆虫<em&gt;ハチノスツヅリガ</em&gt;細菌性病因を調査するための強力な感染モデルとして

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

自然送信時に結核マラリア重複感染を研究する実験モデル結核菌とマラリアベルゲイ</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

母体・胎児のインターフェイスでの感染症を研究するためにヒト胎盤および脱落膜器官培養

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

脂質好中球の変化と好中球細胞外トラップのその後の形成を研究する方法

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their mucus-plugged bronchioles create a favorable habitat for microbial colonization. Various pathogens thrive in this environment interacting with each other and driving many of the symptoms associated with CF disease. Like any microbial community, the chemical conditions of their habitat have a significant impact on the community structure and dynamics. For example, different microorganisms thrive in differing levels of oxygen or other solute concentrations. This is also true in the CF lung, where oxygen concentrations are believed to drive community physiology and structure. The methods described here are designed to mimic the lung environment and grow pathogens in a manner more similar to that from which they cause disease. Manipulation of the chemical surroundings of these microbes is then used to study how the chemistry of lung infections governs its microbial ecology. The method, called the WinCF system, is based on artificial sputum medium and narrow capillary tubes meant to provide an oxygen gradient similar to that which exists in mucus-plugged bronchioles. Manipulating chemical conditions, such as the media pH of the sputum or antibiotics pressure, allows for visualization of the microbiological differences in those samples using colored indicators, watching for gas or biofilm production, or extracting and sequencing the nucleic acid contents of each sample.

The mucus plugged airways of cystic fibrosis (CF) patients are an ideal environment for microbial pathogens to thrive. The manuscript describes a novel method for studying the CF lung microbiome in an environment that mimics where they cause disease and how alterations of chemical conditions can drive microbial dynamics.

WinCFモデル - 肺感染症の微生物学を研究するための粘液で閉鎖された細気管支の安価で収縮可能なマイクロコスモス

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...