この方法は、直接細胞リプログラミングに基づく単純で、難易なインビトロプラットフォームを提供することにより、ヒト造血の研究における限界を克服するのに役立ちます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、レンチウイルス産生、線維芽細胞導入および細胞培養中にヒトヘモジェニック細胞を生成するための基本的なステップにおける理想的なガイダンスを提供する。皮膚線維芽細胞を血原性前駆体に変換することで、幹細胞移植に十分な数の患者特異的造血幹細胞および前駆細胞を生成したいと考えています。
100ミリの組織培養でHEK293T細胞を成長させることから始め、摂氏37度で10ミリリットルの完全なDMEMを、合流するまで5%の二酸化炭素を処理した。トランスフェクションの前日に、培地を吸引した後、PBSの5ミリリットルで慎重に皿を洗い、解離液の1.5ミリリットルで細胞を取り外します。摂氏37度で5~10分間インキュベートした後、3ミリリットルの完全DMEMで溶液を不活性化し、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。
完全なDMEMの5ミリリットルで皿を洗って、残りの取り付けられた細胞を取り除き、細胞溶液で洗浄を引っ張ります。遠心分離によって細胞を収集し、上清を吸引し、完全なDMEMの6ミリリットルでペレットを再懸濁する。次いで、6つの100ミリメートル組織培養物の間で懸濁液を均等に分割し、1皿当たり完全なDMEMの最終体積10ミリリットルで処理した。
翌日、3つの転写プラスミドの総質量を10マイクログラム加え、新しい15ミリリットルの円錐管に加えます。次に、ギャグ、pol、タット、およびrev遺伝子をコードする第2世代のpsPAX2パッケージングベクターの10マイクログラムを追加し、続いて5マイクログラムのpMD2を追加する。管にVSV−G遺伝子をコードするGエンベロープベクター。
最後に、水を加える500マイクロリットルに最終容積をもたらします。2つの新しい15ミリリットルの円錐形チューブに、FUW-M2rtTAプラスミドの10マイクログラム、包装ベクターの10マイクログラム、および各チューブにエンベロープベクターの5マイクログラムを追加します。次に、各チューブに500マイクロリットルの最終体積に水を加えます。
次に、3本のチューブのそれぞれに62.5マイクロリットルの塩化モルカルシウムを加え、パスツールピペットを装備したピペットコントローラを使用して各混合物に気泡を放出します。気泡が形成されている間に、パスツールピペットに対して滴下してBES緩衝生理食塩水の500マイクロリットルを加え、混合物に加えます。混合物がわずかに曇って見えるまで、少なくとも15分間室温でチューブをインキュベートします。
インキュベーション中、HEK293T細胞培養物の上清を抗生物質を使わずに10ミリリットルの完全なDMEMに慎重に交換してください。DNA複合体を個々のHEK293T細胞培養皿に滴下して分配し、24時間インキュベートする。翌日、上清を培養ごとに完全なDMEMの4ミリリットルに置き換え、食器を摂氏37度5%炭酸ガス細胞培養インキュベーターに一晩戻します。
翌朝、上清を1皿あたり50ミリリットルチューブに集め、各皿に新鮮な媒体を4ミリリットル加えます。さらに8時間の培養の後、以前に収穫された上清を各皿に盛り付け、新鮮な培地を4ミリリットル加えます。一晩細胞培養インキュベーターに皿を返し、上清を1回最後に集める。
すべてのウイルスが収集されたら、0.45マイクロメートルの低タンパク質結合フィルターを介して各レンチウイルス上清を個々のチューブにフィルターし、遠心分離のために個々の遠心フィルターユニットに最大15ミリリットルの濾過上清を加えます。フローを破棄します。液体を含む粘性レンチウイルスは、フィルターユニットに残ります。
レンチウイルス上清の全てが、冷蔵用濃縮レンチウイルスのアリコート50〜200マイクロリットルを濾過した場合。リプログラミング手順を開始する前に、1ウェルあたり0.1%ゼラチンの500マイクロリットルで6つのウェル組織培養処理プレートをコード化し、37°Cで20分間プレートをインキュベートします。インキュベーションの終了時に、残りのゼラチン溶液を吸引する。
ヒト皮膚線維芽細胞を1.5倍の密度でプレート10~5番目の細胞で、1プレート当たり2ミリリットルの完全なDMEMで十分にプレートし、一晩インキュベートする。翌朝、各井戸の培地を、1ミリリットルポリブレンあたり8マイクログラムで補った完全なDMEMの2ミリリットルに置き換え、新しいマイクロ遠心チューブにプール生産された転写因子レンチウイルスとM2rtTAの混合物を1対1に加える。次いで、レンチウイルス混合物の最適な体積で線維芽細胞を、ウェルあたり10〜100マイクロリットルの間でトランスデュースする。
16時間のインキュベーションの後、上清を完全なDMEMに置き換え、細胞を6〜8時間培養インキュベーターに戻します。回復後、ポリブレンを補充した完全なDMEMの2ミリリットルで上清を交換し、ちょうど実証したように2番目の形質転換を行います。2回目のトランスダクションインキュベーションの終わりに、上清を、ドキシサイクリンのミリリットル当たり1マイクログラムで補った完全なDMEMに置き換え、プレートを細胞培養インキュベーターに48時間戻します。
インキュベーションの終わりに、1〜2の比率で各ウェルを分割し、新しいゼラチンコーティング6ウェルプレートでドキシサイクリンを添加した造血培地のウェルあたり2ミリリットルの細胞を再プレートします。クロマチン免疫沈降シーケンシング解析に十分な数の細胞を得るために、ゼラチンに10〜5番目の線維芽細胞を3回10回プレートコーティングした6つのウェルプレートを塗布し、一晩インキュベートする。インキュベーションの終了時に、細胞を2日連続で2回、関心のある個々の因子またはFUW-M2rtTAのプールを1対1の割合で含むレンチウイルスの10〜20マイクロリットルでトランスデュースする。
2回目の導入から16時間後、上清を含むウイルスを除去し、24時間完全なDMEMで細胞をインキュベートする。インキュベーションの終わりに、各ウェルの内容物を個々のゼラチンに再プレートし、完全なDMEMで100ミリメートルの組織培養処理された料理を1皿あたり10ミリリットルの培地の最終体積にして、細胞培養器に細胞を戻す。6日後、上清をドキシサイクリンを補充した完全なDMEMに置き換えます。
培養物をさらに2日間培養器に戻します。これらの代表的なサイトメトリープロットが示すように、再プログラムされた細胞の約17%は、25日間のリプログラミングの後にCD49fとCD9の両方を発現する。二重陽性細胞の大部分はCD143を発現し、小集団はCD34を発現し、動的な血原性運命誘導を示唆している。
これらのマーカーは、25日間培養されたヒト皮膚線維芽細胞をM2rtTAで活性化しない。免疫蛍光イメージングは、これらのマーカーに対して陰性である線維芽細胞と形態的に区別される接着細胞および丸型細胞におけるCD9およびCD143の発現を確認する。ブライトフェイルイメージングは、リプログラミングプロセス全体で細胞の合流、形態、コロニー形成を可視化するために行われます。
再プログラムされた細胞の単一細胞RNAシーケンシング分析は、CD49f、CD9、およびCD143発現の2日目から25日目までの段階的な増加を明らかにする。クロマチン免疫沈降シーケンシング後、ゲノムブラウザプロファイルは、線維芽細胞が3つの因子またはGATA2と個別にコトランスタイズされたときに、ITGA6およびACEのゲノム調節領域にGATA2結合を示す。培養に添加される抗ウイルス粒子の量は、細胞の生存率を損なうことなく、リプログラミングを成功させるために最適化されるべきである。
このプラットフォームは、CRISPR-Cas9などの薬理学的阻害およびゲノムスケールスクリーニング技術と組み合わせて、ヒト決定的造成の新しい調節因子を定義することができます。この直接リプログラミングアプローチにより、研究者はヒト発達造血の分野における新たな疑問を探求し、ヒト造血幹細胞の仕様の基礎となるメカニズムを解読することができます。レンチウイルス作業専用の層流フードで抗ウイルス収集とトランスダクションを行い、ウイルス汚染廃棄物を適切な容器に廃棄することが重要です。
