高効率のため、この方法は、ヒト疾患を研究し、新しい幹細胞療法を開発するためのツールとして、誘導多能性幹細胞、またはIPSCをさらに進めることができます。このプロトコルの主な利点は、再プログラムが困難、疾患関連、老化、老化線維芽細胞を含む原発性ヒト線維芽細胞から高品質の統合フリーIPSCを生成する能力である。この方法の成功は、線維芽細胞の最適なRNAトランスフェクション効率に依存する。
トランスフェクションバッファーの pH を調整することは、これを達成するための重要な手順です。開始するには、500ミリリットルと100ミリリットルの室温で新鮮な減らされた血清培地のボトルを事前に温め、トランスフェクションバッファーを調製します。バッファーにpHメーターのガラス電極を挿入することにより、500ミリリットルのボトルで媒体のベースpHを測定し、pHを読み取る前に1分まで待ちます。
pHを調整するには、水酸化ナトリウム1モル3~4ミリリットルを500ミリリットルのボトルに加えます。ボトルを閉じてよく混ぜます。5分間待った後、ボトルを開け、pHメーターの電極をバッファーに挿入します。
pHメーターの読み取り値が安定するまで待ちます。pHが8.15〜8.17に達するまで、1モル水酸化ナトリウムの少量を追加し続け、プロセス中にpHメーターを数回較正することを確認します。トランスフェクションバッファーをフィルター処理するには、0.22 マイクロメートル真空ろ過システムを使用します。
最小の空域で5ミリリットルの管に殺菌された緩衝液をアリコート。再プログラムされる線維芽細胞が40%〜60%の合流性であることを確認してください。4ミリリットルのDPBSを15ミリリットルの円錐状チューブに移し、100マイクロリットルの組換えヒトラミニン521を加える。
上下にピペットを入れ、十分に混ぜます。希釈された組み換えヒトラミニン521の井戸当たり1ミリリットルを6つのウェルプレートの3つの井戸に加えます。このコーティングされたプレートを摂氏37度で2時間インキュベートします。
このインキュベーションの間、6ミリリットルの線維芽細胞拡張培地と4ミリリットルのめっき培地を摂氏37度に温める。1ミリリットル当たり100ナノグラムの最終濃度で基本FGFとメッキ媒体を補い、1ミリリットル当たり200ナノグラムの最終濃度でB18Rを。40~60%合流の線維芽細胞から使用済み培地を慎重に吸引する。
5ミリリットルのDPBSで細胞をすすいでください。3ミリリットルのトリプシンEDTAを加え、プレートをそっと揺らし、トリプシンEDTAで細胞を覆います。余分な液体を吸引し、約500マイクロリットルのトリプシンを残し、繊維芽細胞を摂氏37度で3分間インキュベートする。
インキュベーターからプレートを取り外した後、しっかりと、しかし慎重に細胞を外すためにプレートの側面をタップします。顕微鏡下の細胞を見て、それらが取り外されたかどうかを確認します。切り離された細胞に5ミリリットルの線維芽細胞拡張培地を加えて、トリプシンEDTAを中和する。
15ミリリットル円錐形のチューブに細胞を収集し、よくそれらを混合します。ヘモサイトータを用いて細胞を数え、次いでピペット12,000細胞を事前に調製した事前に温めためっき培地の4ミリリットルに入れた。インキュベーターから被覆されたプレートを取り除いた後、ウェルからラミニン521を吸引し希釈し、ウェルの表面が乾燥しないことを確認する。
めっき培地中の細胞を穏やかに再懸濁し、コーティングされた各ウェルに1ミリリットルの細胞懸濁液を加えます。低酸素または酸素を5%に設定した三ガス組織培養インキュベーターにメッキされた細胞を入れ、下下、左右の動きの間で交互に細胞を穏やかに完全に分散させ、さらに2回動きを繰り返し、プレートを渦巻かないようにします。細胞を一晩インキュベートする。
一方、15ミリリットルの円錐状チューブに4ミリリットルのリプログラミング培地を加え、一晩平衡化するために緩めたキャップを持つ低O 2インキュベーターに入れます。トランスフェクションの少なくとも1時間前に、低O2インキュベーターから平衡型リプログラミング培地を取り除く。1ミリリットル当たり100ナノグラムの最終濃度にbFGFを加え、B18Rを1ミリリットル当たり200ナノグラムの最終濃度に加え、よく混ぜます。
一度に1つの井戸を働いて、使用済み培地を取り除くために1ミリリットルのピペットを使用してください。そして、1ミリリットルのリプログラミング培地に置き換え、bFGFおよびB18Rを補充する。低酸素インキュベーターに細胞を持つプレートを戻します。
線維芽細胞トランスフェクションを開始するために、まずトランスフェクションバッファーのアリコートを室温で約1時間平衡化する。修飾MRNAの13マイクロリットルのアリコートを取り除き、MIRNA模倣物の14マイクロリットルのアリコートをマイナス80°Cから取り除き、解凍するまで約3〜5分間室温まで温めます。マイクロフュージでそれらを短時間回転させます。
トランスフェクション試薬を室温まで約3~5分間温めます。チューブを2~3回反転して試薬を混合し、マイクロフュージで短時間スピンダウンします。室温トランスフェクションバッファーの 279 マイクロリットルを RNA フリーマイクロ遠心チューブに移し、トランスフェクション試薬の 31 マイクロリットルを加えます。
ピペットで十分に混ぜ、室温で1分間インキュベートします。室温トランスフェクションバッファーの 132 マイクロリットルを変更 MRNA の 33 マイクロリットルアリコートに加え、ピペットを軽く混合します。MIRNAの14マイクロリットルのアリコートに室温トランスフェクションバッファーの102.6マイクロリットルを加え、穏やかにピペットを混ぜ合わせます。
改変MRNAのトランスフェクションミックスを調製するために、トランスフェクションバッファーの310マイクロリットルの165マイクロリットルを加え、トランスフェクション試薬ミックスを165マイクロリットルのトランスフェクションバッファーに、改変MRNAミックスする。ミキシングするピペット。MIRNA模倣物のトランスフェクションミックスを調製するために、310マイクロリットルトランスフェクションバッファーの116.6マイクロリットルを加え、トランスフェクション試薬ミックスを116.6マイクロリットルトランスフェクションバッファーに、MIRNA模倣ミックス。
よく混合し、室温で15分間インキュベートし、トランスフェクションバッファーが修正されたMRNAおよびMIRNAの模倣と複雑になります。低酸素インキュベーターから細胞を含むプレートを取り除きます。各ウェルを横切って賢明にドロップし、複雑化した改変MRNAを含むトランスフェクションミックスのウェルあたり100マイクロリットルを追加します。
プレートを上に下げて十分に攪拌し、右の動きを左にしてトランスフェクション複合体を分散させます。複雑なMIRNAを含むトランスフェクションミックスのウェルあたり66.7マイクロリットルを加え、各井戸全体に落とします。プレートを上に下げて十分に攪拌し、右の動きを左にしてトランスフェクション複合体を分散させます。
トランスフェクションされた細胞を含むプレートを低酸素の三ガスインキュベーターに入れる。トランスフェクション複合体を、上に下にしてプレートを十分に攪拌し、右の動きを緩やかに攪拌して分散させます。翌日培地を変える前に、16〜20時間インキュベーターでトランスフェクトされた細胞をインキュベートする。
リプログラミング培地を4ミリリットルを15ミリリットルの円錐チューブに加え、一晩平衡化するために緩めたキャップを持つ低O 2インキュベーターに入れます。翌朝、トランスフェクション含有培地をbFGFおよびB18Rで補充された新鮮な事前平衡培地に置き換え、プロトコルに記載されているようにトランスフェクションレジメンを継続する。リプログラミング用の6つのウェルフォーマット皿の井戸にメッキに成功した後、線維芽細胞は非常にまばらに見えました。
最初のトランスフェクションに成功してから24時間後、線維芽細胞は紡錘の形を失い、より丸みを帯びた形態を採用した。最初の3つのトランスフェクションを通じて、細胞密度は徐々に一貫して増加し、7日目から8日目の間に起こる明らかな増殖バーストで増加した。10日目までに、細胞は主にコンフルエントに現れた。
最初のIPSCコロニーは早ければ11日目に出現した。15日から17日目までに、IPSCコロニーは大きく、明白になり、周囲と完全に再プログラムされた線維芽細胞とは明らかに区別された。多能性マーカーTRA-1-60に対する免疫染色は、高いリプログラミング効率を確認した。
最適でないめっき密度は、このプロトコルにおけるリプログラミングの効率を低下させる最も一般的な理由です。めっき密度が低すぎると、大きな細胞バロンパッチが出現し、IPSCコロニーが形成されなかった。再プログラムされた細胞の希釈の通過に続いて、IPSCは単一のコロニーとして成長し、線維芽細胞から容易に区別できた。
それらは緩やかに詰め込まれ、個々の細胞は比較的大きな細胞質領域を有していた。4~7日間の間に、IPSCは増殖し、定義されたエッジを持つ特徴的な密集したコロニーを形成しました。コロニー内の個々の細胞は、顕著な核子を有する大きな核分画を示した。
患者線維芽細胞を再プログラミングした後、得られたIPSCは、メカニズムを引き起こす疾患を解明したり、新しい再生細胞ベースの治療薬を開発するために、様々な体細胞に分化することができる。
