Bu yöntem, doğrudan hücre yeniden programlamadayalı basit ve çekilebilir in vitro platform sağlayarak insan hematopoetik gelişimi çalışma sınırlamaları aşmak yardımcı olur. Bu yöntemin görsel gösterimi, merceksi viral üretim, fibroblast transdüksiyonu ve hücre kültürü sırasında insan hemojenik hücreleri oluşturmak için temel adımlarda ideal rehberlik sağlayacaktır. Deri fibroblastlarını hemojenik öncüllere dönüştürerek, kök hücre nakli için yeterli sayıda hastaya özgü hematopoetik kök ve ata hücreleri oluşturmayı umuyoruz.
Hek293T hücrelerini 100 milimetrelik doku kültüründe büyüterek başlayın ve 37 santigrat derecede 10 mililitre tam DMEM ve %5 karbondioksit le tedavi edin. Transfeksiyondan bir gün önce, orta yıkayımı yaptıktan sonra, yemeği beş mililitre PBS ile dikkatlice yıkayın ve hücreleri 1,5 mililitre ayrıştırma çözeltisi ile ayırın. 37 santigrat derecede 5 ila 10 dakika kuluçkaya yattıktan sonra, çözeltiyi üç mililitre tam DMEM ile inaktive edin ve hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.
Kalan bağlı hücreleri çıkarmak ve hücre çözeltisi ile yıkamayı çekmek için yemeği 5 mililitre tam DMEM ile yıkayın. Santrifüj ile hücreleri toplamak, supernatant aspire ve tam DMEM altı mililitre pelet resuspend. Daha sonra, altı 100 milimetre doku kültürü arasında eşit süspansiyon bölünmüş çanak başına tam DMEM 10 mililitre son hacminde yemekleri tedavi.
Ertesi gün, yeni bir 15 mililitre konik tüp birlikte üç transfer plazmidler 10 mikrogram toplam kitle ekleyin. Daha sonra, psPAX2 ambalaj vektörü gag, pol, tat ve devir genleri kodlama ikinci nesil 10 mikrogram ekleyin pMD2 beş mikrogram eklenmesi izledi. VSV-G genini tüpe kodlayan G zarf vektörü.
Son olarak, 500 mikrolitre son hacmi getirmek için su ekleyin. İki yeni 15 mililitrelik konik tüpler, FUW-M2rtTA plazmid 10 mikrogram, ambalaj vektör10 mikrogram ve her tüp için zarf vektör beş mikrogram ekleyin. Daha sonra, her tüp için 500 mikrolitre son hacmine kadar su ekleyin.
Daha sonra, üç tüpün her birine iki azı kalsiyum klorür 62,5 mikrolitre ekleyin ve her karışıma kabarcıklar serbest bırakmak için pasteur pipet ile donatılmış bir pipet denetleyicisi kullanın. Kabarcıklar oluştururken, Pasteur Pipet karşı ve karışım üzerine bes tamponlu tuzlu 500 mikrolitre ekleyin. Karışımları biraz bulutlu görünene kadar en az 15 dakika oda sıcaklığında tüpler kuluçka.
Kuluçka sırasında, HEK293T hücre kültürlerinin süpernatantını antibiyotiksiz tam 10 mililitre tam DMEM ile dikkatlice değiştirin. DNA komplekslerini tek tek HEK293T hücre kültürü tabaklarına dağıtın ve 24 saat kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, kültür başına tam DMEM dört mililitre ile supernatants değiştirin ve 37 derece santigrat% 5 karbondioksit hücre kültürü kuluçka gecede yemekleri dönmek.
Ertesi sabah, çanak başına bir 50 mililitrelik tüp içine supernatants toplamak ve her yemek için taze orta dört mililitre ekleyin. Kültür sekiz saat sonra, havuz daha önce hasat supernatant ile her çanak supernatant ve taze orta dört mililitre ekleyin. Bir gecede hücre kültürü kuluçka için bulaşıkları dönün ve supernatants son bir kez toplamak.
Tüm virüs toplandığında, her lentiviral supernatant tek tek tüpler içine 0,45 mikrometre düşük protein bağlama filtresi ile filtre ve santrifüj için bireysel santrifüj filtre üniteleri için filtre supernatant maksimum 15 mililitre ekleyin. Akışı atın. Sıvı içeren viskoz bir lentivirüs filtre ünitesinde kalacaktır.
Tüm lentiviral supernatant soğuk depolama için konsantre lentivirüslerin 50 ila 200 mikrolitre aliquot filtre edilmiştir. Yeniden programlama prosedürübaşlamadan önce, kod altı iyi doku kültürü iyi başına% 0.1 jelatin 500 mikrolitre ile plaka tedavi ve 37 santigrat derece 20 dakika boyunca plaka kuluçka. Kuluçka sonunda, kalan jelatin çözeltisi aspire.
Plaka insan dermal fibroblastlar bir yoğunlukta 1.5 kat on plaka başına beşinci hücreler için iyi başına tam DMEM iki mililitre ve tüplü gecede. Ertesi sabah, tam DMEM mililitre mililitre mililitre başına mililitre polibren ve havuz üretilen transkripsiyon faktörü lentiviruses ve M2rtTA yeni bir mikrosantrifüj tüp üretilen bire bir karışımı ekleyin. Daha sonra, merceksi viral karışımın optimal hacmi ile fibroblast transduce, arasında 10 için 100 mikrolitre kuyu başına.
16 saatlik kuluçkadan sonra, süpernatantları tam DMEM ile değiştirin ve hücreleri altı ila sekiz saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri verin. Kurtarma dan sonra, polibren ile takviye tam DMEM iki mililitre ile supernatants değiştirin ve sadece gösterildiği gibi ikinci bir transdüksiyon gerçekleştirin. İkinci transdüksiyon inkübatasyonunun sonunda, süpernatantları doksisiklin mililitresi başına bir mikrogramla takviye edilmiş komple DMEM ile değiştirin ve plakayı 48 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri verin.
Kuluçka sonunda, yeni bir jelatin kaplı altı iyi plaka doksisiklin ile desteklenen hematopoetik orta kuyu başına iki mililitre her kuyuda bir iki oranında her iyi bölünmüş. Kromatin immünopresipitasyon dizianalizi için yeterli sayıda hücre elde etmek için, bir jelatin kaplı altı iyi plaka ve tüplü bir gecede beşinci fibroblastlar için plaka üç kez 10. Kuluçka sonunda, iki gün üst üste iki kez hücreleri ile 10-20 mikrolitre lentivirus ilgi bireysel faktörler veya üç faktör artı FUW-M2rtTA bir-bir oranda bir havuz içeren hücreleri transduce.
İkinci transdüksiyondan 16 saat sonra supernatant içeren virüsü çıkarın ve hücreleri tam DMEM'de 24 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, her kuyunun içeriğini tek tek jelatin kaplı 100 milimetrelik doku kültürüne yeniden yerleştirin ve tabak başına 10 mililitre lik son bir hacimle tam DMEM ile yapılan yemekleri tedavi edin ve hücreleri hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Altı gün sonra, doksisiklin ile takviye tam DMEM ile supernatant değiştirin.
Kültürleri iki gün daha kuvöze geri döndürün. Bu temsili sitometri çizimlerinin de gösterdiği gibi, yeniden programlanan hücrelerin yaklaşık %17'si 25 günlük yeniden programlamadan sonra hem CD49f hem de CD9'u ifade eder. Çift pozitif hücrelerin çoğunluğu CD143 ve küçük bir popülasyon ifade CD34, dinamik bir hemojenik kader indüksiyon düşündürmektedir.
Bu belirteçler M2rtTA transek insan dermal fibroblastlar 25 gün boyunca kültürlü aktive değildir. İmmünofloresan görüntüleme, bu belirteçler için negatif olan fibroblastlardan morfolojik olarak farklı olan yapışık ve yuvarlak hücrelerde CD9 ve CD143 ekspresyonunu doğrular. Brightfeild görüntüleme yeniden programlama süreci boyunca hücre birleşimi, morfoloji ve koloni oluşumunu görselleştirmek için yapılır.
Yeniden programlanmış hücrelerin tek hücreli RNA dizianalizi, CD49f, CD9 ve CD143 ekspresyonunda ikinci günden 25'e kadar adım adım artış olduğunu ortaya koymaktadır. Kromatin immünopresipits sekestrasyonundan sonra Genom Tarayıcı profilleri, fibroblastlar üç faktör veya GATA2 ile ayrı ayrı kotransdüktedildiğinde, GATA2'nin ITGA6 ve ACE'nin genomik düzenleyici bölgelerine bağlayacagını göstermektedir. Kültüre eklenen antiviral parçacıkların hacmi hücre canlılığından ödün vermeden başarılı yeniden programlama için optimize edilmelidir.
Bu platform farmakolojik inhibisyon ve genom ölçekli tarama teknolojileri ile birleştiğinde olabilir, CRISPR-Cas9 gibi, insan kesin hematopozis yeni düzenleyiciler tanımlamak için. Bu doğrudan yeniden programlama yaklaşımı, araştırmacıların insan gelişimsel hematopogenezi alanında yeni sorular keşfetmelerine ve insan hematopoetik kök hücrelerinin spesifikasyonunun altında yatan mekanizmaları deşifre etmesine olanak sağlayacaktır. Lentiviral iş için ayrılmış bir laminar akış kaputunda antiviral koleksiyonları ve transdüksiyonları gerçekleştirmek ve uygun bir konteyner içine viral kontamine atık atmak önemlidir.
