微小生理学的システムは、興味のある特定の治療に対する人体の薬物動態および毒物学的応答をエミュレートする能力を有する。微生物学的システムは、動物実験を置き換える可能性を秘めており、in vitro法の予測力を向上させ、薬理薬性および毒物学的研究のコストと時間を削減することができます。被験物質投与の24時間前に、ウィリアムES培地の800マイクロリットルのアリコートを2つのオルガンチップのより大きく、より小さい区画の間に分割し、調製した24のウェルプレートに相当する各腸壁からバソララルおよびアピカル培地を吸引する。
滅菌鉗子を使用して、2つのオルガンチップ回路ごとに1つのインサートを大きなコンパートメントに統合し、200マイクロリットルのDMEMSを補助側に加えます。広いボアチップを使用して、回路あたり20の肝臓相当量を2つのオルガンチップの小さなコンパートメントに統合し、システムを制御ユニットに接続します。次に、コントロールユニットを加圧空気供給に接続し、圧力を約プラスマイナス300バー、0.3ヘルツのポンピング周波数に設定します。
翌日、ストックアセトアミノフェン溶液を12マイクロモル濃度に希釈します。系内の培地を交換するには、2つの器官チップの腸壁と同等の腸壁からバソララルおよびアピカル培地を吸引し、500マイクロリットルの新鮮な適切な培養培地をオルガノイドバソラショナル側の大きなコンパートメントに加え、300マイクロリットルを小区画に加える。気泡を確認した後、腸培養インサートのアプリカル側に12マイクロモルアセトアミノフェン溶液を200マイクロリットル加えて経口投与をエミュレートし、マイクロ生理学的システムを制御ユニットに接続します。
腸の尖体側とバソララル側の両方から、また示された時点で三重の小さなコンパートメントから総体積を収集します。すべてのサンプルが収集されたら、表に示されているようにHPLC分析に関連するすべてのパラメータを設定し、真空下で0.4ミクロンの膜フィルターを介して移動相をフィルタリングします。次に、0.22ミクロンの孔サイズPVDFシリンジフィルターでサンプルをフィルターし、サンプルをバイアルに保存してからHPLC UV測定を開始します。
オルガノイドの生存率を評価するには、各複製からすべての20個のスフェロイドを96ウェルプレートの個々のウェルに移し、細胞培養インサートを24ウェルプレートの個々のウェルに移します。洗浄ごとに新鮮なDPBSで組織に相当する量を3回洗浄し、各実験井戸に1ミリリットル当たり1ミリグラムの300マイクロリットルを加えます。細胞培養インキュベーターで3時間のインキュベーションの後、MTT溶液を摂氏4度で一晩インキュベーションするために、MTT溶液を1ウェル当たり200マイクロリットルのイソプロパノールに置き換え、腸および肝臓当量からMTT formazanを抽出する。
翌朝、各上澄み物の200マイクロリットルを96ウェルプレートの適切なウェルに移し、570ナノメートルのプレートリーダーでformazanを読み取り、負のコントロールと比較して各時間ポイントの平均光学密度を使用してMTTを低減する細胞の相対的な能力を計算できるようにします。サンプルの細胞化学的および組織学的分析のために、まず、腸および肝臓等価物を4%パラホルムアルデヒドに0.1モルPBSで25分間室温で固定する。インキュベーションの終わりに、オルガノイドをPBSで1回10分間5回洗浄し、腸および肝臓の同等物をテトラメチルロカミンイソチオシアネートファロイケイ素アレクサフルオール647ファロイジンで室温で1時間染色する。
インキュベーションの終わりに、液体窒素中の組織をスナップ凍結する前に、サンプルを凍結培地に数分間移します。次に、クライオスタットを使用して、10〜12ミクロンの厚い肝スフェロイドクライオ切片を取得し、共焦点蛍光顕微鏡によるイメージング用DAPI付きの取り付け媒体に組織切片を取り付ける。ミトコンドリア染色と核染色の場合、ミトコンドリア染色液でサンプルを完全に覆い、5%の二酸化炭素を加湿した雰囲気で摂氏37度で15~45分間インキュベーションします。
インキュベーションの終了時に、PBSで2〜4%パラホルムアルデヒドを室温で15分間慎重に交換してください。固定後、新鮮なPBSで1回5分間、細胞を穏やかに洗い流してから、室温で10分間核酸染色作業溶液でサンプルをラベリングします。インキュベーションの終わりに、光から保護されたPBSで3、5分の洗浄でサンプルを洗浄し、核酸染色を使用して、適切なフィルターセットを用いて蛍光顕微鏡上で細胞を発現するミトコンドリア染色の数を定量化しやすくする。
ヒト腸バリアと肝臓等価物を2つの臓器チップ微小流体装置に統合することで、目的の治療の薬物動態学的および毒物学的特性の評価が可能になる。処理後、培地サンプルはHPLCにより分析することができる。オルガノイドは、遺伝子発現、トランス上皮電気抵抗値、タンパク質発現および活性、ならびに形態学的特徴について分析することができる。
MTT分析は、オルガノイドの生存率を評価するだけでなく、アセトアミノフェン治療に応答して非常に初期の毒性事象を検出するために行うことができます。培地流れはアセトアミノフェン吸収に有意に影響を及ぼさないが、肝等価機能を有意に改善する一方で、ヒト腸内アセトアミノフェン吸収および肝代謝がこの微小生理学的系でエミュレートできることを示している。微小生理学的システムは、ヒトの生理学をよりよく模倣し、リスクと複雑さに対するより高速かつ低コストで医薬品開発を促進するために使用することができるので、医薬品開発と発見における動物モデルを置き換える可能性を秘めています。
