このプロトコルでは、高機能で代謝的に活性な肝微小組織を最大4週間維持できる微生物学的システムを使用して、in vitroで薬物誘発性肝障害を評価する方法を説明しています。このアプローチは、新規化合物に対する薬物誘発性肝障害責任を正確に検出するためのヒト特異的細胞培養モデルであり、単純な2D培養またはさらに複雑な3D培養よりも予測的です。この手法は、化合物が臨床開発を開始しても安全かどうかを判断するための一連の前臨床安全性試験の一部として使用できます。
さまざまなモダリティをテストできます。コントローラーを細胞培養インキュベーターのドッキングステーションハウスに接続して、肝臓の微小生理学的システムのセットアップを開始します。コントローラーの背面にある乾燥剤ジャーに新しい乾燥剤が追加されていることを確認してください。
ボートロッカースイッチを押してコントローラーの電源を入れた後、システムが安定して圧力に達するまで5分間待ちます。各プレートをパッケージから取り出します。次に、500マイクロリットルの予め温めた播種高度DMEM培地をリザーバ側に添加して各ウェルをプライミングする。
ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに置きます。完了したら、液体がフィルターサポートを通過するまで、コントローラー画面でプライムプログラムを選択します。表面チャネルを覆うために、すべてのウェルに1.1ミリリットルの播種高度DMEM培地を充填します。
プレート付きのドライバーを摂氏37度と5%の二酸化炭素のインキュベーターに入れた後、ドッキングステーションを接続し、インキュベートプログラムを実行します。PHHおよびHJCのバイアルを摂氏37度の水浴に保持して、氷のわずかなスライバーだけが残るまで解凍します。解凍したら、最大2本のPHHバイアルを、事前に温めた凍結保存された肝細胞回収培地であるCHRM培地のチューブに直接静かにピペットで入れます。
次に、1ミリリットルのCHRMを使用して、クライオチューブから残りの細胞を洗い流します。HKCをクライオチューブから50ミリリットルの遠沈管内の10ミリリットルの氷冷播種アドバンスドDMEM培地に穏やかにピペットで入れます。その後、両細胞型を別々に室温で100倍Gで10分間遠心分離する。
遠心分離後、上清を除去し、チューブに添加した細胞のバイアルあたり1ミリリットルを使用して、温かい播種高度DMEM培地および氷冷播種高度DMEM培地中のHKCsにPHHを再懸濁します。穏やかな揺動作用で細胞を再懸濁してから、氷の上に置きます。懸濁したら、細胞を数え、生存率を記録します。
細胞の生存率は85%以上でなければなりません次に、ドライバーをドッキングステーションから外し、ドライバーを微生物学的安全キャビネットまたはMBSCに入れます。次に、培地を足場の上から停止点、チャネル、およびリザーバーまで吸引し、培養ウェルに0.2ミリリットルのデッドボリュームを残し、足場のすぐ上に到達します。400マイクロリットルの高度なDMEM培地をウェルチャンバーに追加してから、ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに戻し、培地交換プログラムを3分間実行します。
3 分後、ドッキング ステーションからドライバを取り外し、MBSC に戻します。上記の足場から各ウェルの停止点およびリザーバー端まで培地を吸引し、続いてチューブを穏やかに揺らしてPHHを再懸濁し、必要量の細胞懸濁液を各培養ウェルに追加します。細胞懸濁液を慎重にピペットでピペッティングし、プレート足場全体に細胞が均一に分散するようにします。
HKCを注意深く再懸濁し、細胞懸濁液を各培養ウェルに追加します。すべてのウェルに両方の細胞タイプが含まれたら、物理的に接続せずにマイクロ生理学的システムまたはMPSドライバーをインキュベーター内のドッキングステーションに配置して1時間静置します。1時間が経過したら、ドライバーをドッキングステーションに接続し、シードプログラムを実行します。
プログラムが2分で自動的に一時停止したら、インキュベーターからドライバーを取り外し、1, 000マイクロリットルの播種高度DMEM培地をチャネルにゆっくりと加えて、総容量1.4ミリリットルを達成します。その後、プレートをインキュベーターに移動し、残りのシードプログラムを8時間実行します。4日目に、コントローラーのプログラムを一時停止し、ドライバーとプレートをドッキングステーションから外します。
それらを MBSC に転送します。ピペットを使用して各ウェルから約1ミリリットルの培地を手動で収集し、足場に触れて細胞培養を妨げることなく可溶性バイオマーカー分析を行います。採取した培地を4日目のサンプルとしてラベル付けし、乳酸デヒドロゲナーゼおよび尿素アッセイを品質管理チェックとして実行して、播種が成功したことを確認します。
次に、培地交換を行ってプレート計画に従って各ウェルを投与する。完了したら、ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに戻し、インキュベートプログラムを実行します。6日目に、ドライバーとプレートをドッキングステーションから外し、MBSCに転送します。
ピペットを使用して各ウェルから約1ミリリットルの培地を収集し、投与後48時間のサンプルとしてラベル付けし、後のアッセイのためにサンプルを摂氏マイナス80度で保存します。8日目に、ピンセットを使用してプレートから足場を取り外し、微小組織を乱すことなく、各ウェルにカルシウムとマグネシウムを含まない500マイクロリットルのDPBSを含む24ウェルプレートに足場を置きます。各足場のスナップショットを倒立光学顕微鏡で10倍の倍率で撮影します。
4日目には、薬物投与の前に、形成された肝臓微小組織の品質管理チェックがLDH放出および尿素合成で実施されました。8日目に、アルブミン、尿素、CYP 3 A 4、ATPなどの複数の健康および肝臓の指標を評価して、微小組織における高レベルの肝機能と再現性を確認しました。肝微小組織における造影相顕微鏡およびIF染色により、PHH微小組織におけるHKCの均一な分布が明らかになった。
肝臓微小組織のトログリタゾンへの急性曝露は毒性を引き起こし、これはアラニンアミノトランスフェラーゼまたはALTによって検出され、LDH放出およびアルブミンおよび尿素産生の急速な減少を引き起こした。ATP含量およびCYP3A4活性はトログリタゾンによる毒性を確認し、EC50値は他の評価項目と同程度であった。MPSで8日間培養した後に撮影された明視野顕微鏡画像は、ビヒクルコントロールの足場全体に均一に播種された健康な肝臓微小組織を明らかにします。
組織死または分解は、ポジティブコントロールおよびトログリタゾンで処理した反復物において見られた。さらに、ピオグリタゾンへの曝露後の肝毒性も調査されました。.LDHまたはALTの放出は検出されなかったが、48時間後にアルブミンおよび尿素産生の軽度の減少が観察された。
ATP含有量のわずかな減少は、高ピオグリタゾン濃度で観察された。EC50値は、用量反応曲線から生成した。顕微鏡検査では、テストされた2つの最高濃度でピオグリタゾンに96時間曝露した後、わずかな微小組織の変化が明らかになりました。
この研究では、85%を超える品質と生存率の高い細胞の使用は、微小生理学的システムで高機能で健康な3D微小組織を生成するために不可欠です。この手順に続いて、非アルコール性デルタ肝炎や非アルコール性脂肪性肝疾患モデルなどの疾患モデルで、肝実質細胞と非実質細胞のトリプル培養を使用したアデニンと薬物間相互作用および薬物誘発性肝障害を評価できます。
