私たちは、サンゴの健康を促進すると同時に、汚染による影響を軽減し、変化する世界におけるサンゴ礁の持続性に貢献できるプロバイオティクスを分離し、組み立てることができます。説明する分離およびスクリーニングアプローチは、サンゴなどの海洋生物に対する汚染物質の分解やその他の有益な特性などの重要な代謝活性を示す微生物を選択するために使用することができる。この方法は、任意の汚染物質を分解することができる微生物を単離するために適用することができる。
さらに、他の材料源は、植物、土壌、水、何かなどの他の環境サンプルに使用することができます。文献を研究し、あなたの目的のための良い候補となり得る株に焦点を当ててみてください。可能であれば、それらの株のための分離方法を指示し、既知の病原体を避ける。
また、細菌のコンソーシアムを使用することを目指している場合は、コンソーシアムのメンバーが互いに敵対的な活動をしているかどうかを最初に調査することも非常に重要です。サンゴは絶滅のリスクが高まっているため、この方法論は世界的に始まっており、その方法を広げて標準化する必要があります。一部のサンゴ研究者は従来の微生物学の経験がないので、彼らは頻繁にそのようなアプローチを進める方法についてのアドバイスを求めています。
まず、各ターゲットサンプリング部位から、スクリューキャップ付きの滅菌ボトルを使用して、3重に500ミリリットルの水を集めます。サンプル処理が後で発生する場合は、ボトルを摂氏4度に保ちます。水のサンプルの同じサンプリングサイトからサンゴの破片をカットするためにペンチと鉗子の無菌ペアを使用してください。
20ミリリットルの無菌3%生理食塩水または人工海水を使用してサンプルサンゴの断片をリンスし、海水のゆるやかに付着した自由な生きた細菌を取り除きます。鉗子を使用して、滅菌生理液を含むスクリューキャップを備えた滅菌容器に各サンゴの破片を入れます。無菌鉗子とペンチを使用して、無菌ペトリ皿のサンゴの破片の5グラムを計量スケールで計量します。
5グラムのサンゴサンプルを無菌モルタルに移し、滅菌害虫を使用してマセレートします。無菌ヘラを使用して、25ミリリットルの塩化ナトリウム無菌溶液と2.5ミリメートルの10〜15個のガラスビーズを含む滅菌培養フラスコに浸化したサンプルを移します。20ミリリットルの滅菌生理食塩水を使用して、乳鉢をチューブに洗浄して、マセレートの最大量を回収します。
異なるサンゴの区画から微生物を取り外すには、フラスコをサンプリング部位の水温で16時間150回gの一定の撹拌下に保ちます。細菌を選択するには、まずサンゴサンプルの滅菌生理液中の10~10~10~10~10~10~10~10~10~10~10~10の水サンプルを実行します。ピペット希釈は、チップを捨てる前に5回上下します。
その後、それぞれ渦を起します。次のシリアル希釈を実行する前に、毎回5秒間サンプルを渦出します。ピペット 3%塩化ナトリウムリソジニーブロス寒天培地を含むペトリ皿上の各希釈のピペット100マイクロリットルをプレートします。
例えば摂氏26度など、目標温度で1~3日間プレートをインキュベートします。1日1回プレートをチェックしてください。ストリークプレート技術を使用して、新しいプレート上に明確な成長形態を提示するコロニーを選択して分離します。
プレート上に純粋なコロニーが生育するために、必要に応じてこのステップを何度も繰り返します。原稿に記載されているように、摂氏4度またはグリセロール中に分離物を保管してください。EE2分解能力試験を行うために、新鮮なプレートから単一コロニーを選び、チューブ内の滅菌LB培地の2ミリリットルで接種する。
グリセロールストックの場合は、10マイクロリットルのグリセロール細菌ストックを取り、LB寒天プレートにストリークします。一晩で摂氏24~28度でインキュベートし、単一のコロニーが成長します。一晩摂氏24〜28度で150倍gで一定の攪拌の下で傾斜LB培地を含むチューブを置きます。
細菌増殖後、細胞を8,000倍gで室温で8分間遠心してペレット化する。上清を捨てます。残りのLBスープを洗浄するには、2ミリリットルの生理食塩水を加え、細胞を再懸濁させる。
炭素源の痕跡がないことを保証するために、洗浄を2回繰り返します。洗浄し、かつ、EE2を含む最小ブッシュネルハース培地で再懸濁細胞を唯一の炭素源として接種する。インキュベーションの16〜72時間後にLB寒天培地上の600ナノメートルと私たちのコロニー形成単位で光学密度によって細菌の成長を評価します。
油水溶性分画と油水不溶性分率を含む最小培地を唯一の炭素源として調製するには、底部にバルブを含むフィルターフラスコに500ミリリットルの無菌蒸留水に1〜2%の原油を加えます。フラスコを24~28°Cで一定の攪拌下に置き、150倍gで48時間保ちます。その後、フラスコを安定した表面に置き、10〜20分待って、可溶性分画と不溶性分画を分離させます。
次に、底部フィルターフラスコを開いて、油水不溶性分率を節約する新しい滅菌フラスコに油水溶性画分を移します。その後、ブッシュネルハース寒天最小培地の2本を準備します。それをオートクレーブ。
油水溶性分率を唯一の炭素源として組み合わせて、500ミリリットルの寒天培地を作ります。油水不溶性分率で同じことを行い、個々のペトリ皿に各媒体の約25ミリリットルを転送します。油分解細菌を分離するには、以前希釈したサンプルとピペット100マイクロリットルの各希釈液を寒天培地を含むペトリ皿に再利用し、それらをプレートします。
あなたのプレートのための否定的なコントロールを維持することを忘れないでください。対象温度で1~3日間、調理し、先ほどの分離手順を繰り返します。このプロトコルでは、微生物は、推定BMC特性を提示する異なる水源およびサンゴナビンから単離され、異なるクラスの汚染物質を分解することができる。
リオデジャネイロ連邦大学環境衛生実験センターから得られた下水処理場で採取した水サンプルを用いて、EE2を分解できる33種類の細菌株を単離した。さらに、油分解細菌を選択する技術を用いて、油水溶性分率と油水不溶性分率の両方を分解することができる20株が単離された。微生物においてスクリーニングされた推定BMC特性は、その中でもサンゴ病原体ビブリオコレラリチカスに対して強い拮抗活性を示す株、尿素を分解できる株、カタラーゼの産生能が良く、かつ潜在的に有益な遺伝子を提示する微生物が見出された。
バイオレメディエーションとBMC接種の両方を採用し、油暴露の影響からサンゴを予測することが可能でした。サンゴから分離された石油バイオレメディエーターPBMCコンソーシアムは、1%の油にさらされたサンゴナビンに接種された。これは、接種のないサンゴの健康と比較して、より良い保存光化学的能力を示した。
サンプルを室温で長時間放置しないでください。さもなければ、微生物群集は変化し、病気関連微生物は他の微生物を増殖させる可能性がある。原油は有毒です。
このまたは使用する他の汚染物質を使用する場合は、適切な個人用保護具を使用してください。この技術は、サンゴの修復と海洋バイオレメディエーションの分野で革新的な方法を開き、地球規模の変化によって引き起こされる経済的、生態学的、社会的影響を最小限に抑えるために使用される可能性があります。
