このプロトコルは、地熱泉からの重金属耐性微生物のスクリーニングと単離のための合理化されたアプローチを記述しています。このアプローチは、バイオセンシングおよびバイオレメディエーションの分野での応用のために世界中で関心が高まっている研究分野を表しています。そこに記載されている方法は、水、食物、土壌、堆積物などの多様な環境源から微生物を単離するために容易に改変することができる。
耐性微生物を同定するための最小阻害濃度は、新しい種または株を特徴付けるための迅速な戦略である。このプロトコルは実行が簡単で、基本的な微生物学技術に関する手動のスキルと経験のみを必要とします。まず、2グラムの収集サンプルを、pHが4または7の新しく調製したルリア・ベルタニ培地の50マイクロライトに接種する。
このサンプルを、サンプリング部位の温度プラスマイナス5°Cでインキュベートします。pHが4または7のルリア・ベルタニ寒天の上に200マイクロリットルのサンプルをプレートし、55度または60°Cの静的状態に48時間保持する。インキュベーション後、単一コロニーを単離し、このストリークメッキサイクルを少なくとも3回繰り返す。
1ミリリットルの凍結細胞ストックを調製するために、一晩増殖した細胞に20%グリセロールを加える。アセトンとドライアイスを混ぜて急速凍結してください。グリセロールストックから接種剤を調製するには、50ミリリットルのルリア・ベルタニに50マイクロリットルを接種する。
成長プロファイルを得るために、この前培養物を10マイクロリットルのルリア・ベルターニで希釈する。光学濃度を0.1に調整するには、600ナノメートルを追加します。これらの細胞をオービタルシェーカーで摂氏55度または60度で16時間増殖させる。
600ナノメートルの光学密度を30分間隔で測定する。このデータから、X軸に時間、Y軸に600ナノメートルの光学密度を持つ曲線。培養培地のpHを変化させた同様の増殖曲線をプロットし、実験室条件に最適なpHを決定するために、グリセロールストックからストリークした単離物を50マイクロリットルのLuria−Bertani培地に接種し、一晩インキュベートする。
この一晩生育した培養物を5,000倍Gで10分間遠心分離し、次いで上清を捨てて培養パレットを収穫する。使用直前に、20ミリモルのトリス-HCL、2ミリモルのEDTA、1.2%トリトンX-100、および1ミリリットルのリソソーム20ミリグラムからなる10ミリリットルの細菌溶解バッファーを調製する。ペレットを180マイクロリットルの細菌溶解緩衝液に再懸濁する。
精製キットの指示に従ってゲノムDNA抽出を行い、UV-VisによりゲノムDNAとその純度を測定する。純度を評価するには、260〜280および260〜230の光学濃度比を決定する。各サンプルの200ナノグラムを0.8%アガロースゲルにロードし、サイズ分布を高さ、重量の分子マーカーと比較することによって、ゲノムDNAの完全性を評価します。
グリセロールストックからの単離物を200ミリリットルのルリア・ベルタニ最適pHおよび温度条件で成長させる。各前培養物を5ミリリットルのLuria-Bertani培地で希釈し、濃度の高い重金属および抗生物質を含む50ミリリットルのポリプロピレンチューブで希釈し、600ナノメートルで0.1の光学密度を得る。細胞をオービタルシェーカーで16時間増殖させ、摂氏55度または60度で毎分180回転させる。
微生物の増殖が起こらないチューブ内の濃度値を特定することにより、抗生物質または重金属の最小阻害濃度を計算する。最小阻害濃度で増殖させた培養液200マイクロリットルをルリア・ベルタニ寒天プレートに播種し、一晩の培養後にコロニーの存在を確認することにより、その濃度が細胞に対して阻害性であり致死的ではないことを確認する。このプロトコルは、ピスカレリ地域からの細菌サンプルを試験するために使用され、単離された微生物の酸性硫酸地熱環境表現型特性評価は、単離されたものがヒ素およびバナジン酸に対してより高い耐性を有し、カドミウムに対して耐性であることを示した。
比較データは、1つの分離物が5価のヒ素に対して強い耐性を有し、2つの分離が3価のヒ素に対する耐性を有することを示唆している。抗生物質耐性試験は、低濃度が使用された場合でも、試験されたすべての抗生物質に対して1つを単離することが高度に感受性であることを示した。対照的に、単離物2種は、クロラムフェニコールおよびテトラサイクリンを除いて試験した全ての抗生物質に対して耐性である。
微生物はおそらく、極端な環境条件下での選択的利点を表すランダムな突然変異または水平遺伝子導入のために抗生物質耐性を獲得した。本研究は、汚染物質を不活性化し、無害な生成物に変換できる環境微生物を選択するためのこのような方法の有用性を実証する。
