このプロトコルは、3Dがんモデルにおいてmigrastatic阻害剤の効果を詳細に決定できることを実証しています。主な利点は、この技術を実行できる容易さとオールインワンアプローチです。この技術は、3D設定での癌研究におけるmigrastatic薬の評価を可能にし、より腫瘍環境関連の環境で薬物の検査を可能にする。
この方法は、癌における細胞傷害性薬物の検査に適用されるか、または、例えば、癌増殖および細胞移動に対する放射線の影響を評価するために適用され得る。培地除去ステップとコラーゲン置換を通常の96ウェルプレートで行い、自信を持たせます。また、共焦点顕微鏡でのトレーニングも不可欠です。
この技術の視覚的なデモンストレーションは、研究者がスフェロイドの繊細な取り扱いと共焦点顕微鏡での使用を理解するために重要です。実験の初日に、標準的な培養培地(この場合はU251)を適当な細胞株に備えておく。組織培養フードでは、0.5ミリリットルのトリプシンを培養液中に加えて、がん細胞をトリプシン化する。
がん細胞をヘモサイトメーターで数え、1ミリリットル当たり3番目の細胞に5倍の10倍の濃度に希釈する。細胞懸濁液を明確にラベル付けされた無菌ユニバーサルチューブに保管してください。細胞の凝集を避けるために、優しい反転によって細胞を再中断します。
ピペットを使用して、96ウェルプレートの各ウェルに200マイクロリットルの細胞培養液を加えます。蒸発を避けるために、各空の井戸に1X PBSの200マイクロリットルを追加します。37°Cでインキュベーターで細胞をインキュベートします。
24時間後、明視野顕微鏡で細胞を確認します。グリオーマ癌細胞株などの細胞株は、24時間以内にウェルの底部にスフェロイドを形成する。スフェロイドをさらに48時間インキュベートして、3Dセルラーアーキテクチャを形成できるようにします。
3日目には、コラーゲン、5X培養培地、水酸化ナトリウム1モル、氷上に1本の20ミリリットルチューブを置きます。冷やされた培養管に10.4ミリリットルの冷たいコラーゲンを慎重にゆっくりと加えます。泡を避けてください。
次いで、1.52ミリリットルの冷たい無菌5X培養培地を静かに加える。泡を避けてください。使用直前に、72マイクロリットルの冷たい無菌水酸化ナトリウムを静かに加え、溶液を氷の上に置きます。
ピペットで泡を避けてやさしく混ぜます。効率的な混合は、媒体中の赤からオレンジレッドへの色の変化につながります。使用するまで氷の上に混合物を残します。
次に、1日目に用意した96ウェルプレートから190マイクロリットルの上澄みを取り除き、ウェルの側面に向かって角度を付けてピペットを使用する。井戸の底に形成された回転楕円体を乱さないように非常に注意してください。コラーゲンミックス100マイクロリットルを各ウェルにそっと加え、井戸の側面をピペットダウンします。
気泡や回転楕円体の乱れを避けてください。残りのコラーゲンミックスを室温で20ミリリットルチューブに入れず、重合を評価します。インキュベーターにプレートを少なくとも10分間インキュベートし、コラーゲンを重合させます。
残ったコラーゲンが半固体とスポンジ状になると、スフェロイドは阻害剤で治療する準備ができています。培地を5ミリリットルに2倍濃度で阻害剤を添加する。ピペット100マイクロリットルの培地は、スフェロイドの乱れを避けるために各ウェルの側面を穏やかに下げる。
各スフェロイドを観察し、明視野顕微鏡で、薬物活性を評価するために、0時間、24時間、48時間、72時間の時間に画像化する。その後、プレートをインキュベーターに戻します。さて、プレートを組織培養フードに入れ、上清を1X PBSの100マイクロリットルにそっと置き換えます。
スフェロイドを乱さないように気を付け、コラーゲンに触れないようにしてください。この洗浄手順をさらに3回繰り返します。各ウェルで最終洗浄を取り除き、1X PBSで4%ホルムアルデヒドの100マイクロリットルに交換してください。
96ウェルプレートをラボベンチに置き、ホイルで覆い、室温で24時間放置します。翌日、ホルムアルデヒドを慎重に取り出し、1X PBSに交換します。この洗浄をさらに3回繰り返します。
次に、1X PBS洗浄を、作りたてのトリトンX-100溶液100マイクロリットルに交換します。室温で30分間インキュベートします。その間、50ミリリットルのPBSと05%の脱脂粉乳を50ミリリットルのチューブで50ミリリットルでブロッキング溶液を調製し、十分に混ぜます。
30分後、トリトンX-100を取り出し、1X PBSで3回洗浄します。各ウェルにブロッキング溶液100マイクロリットルを加え、15分間インキュベートします。次に、ブロッキングバッファー内のIgGアセチル化チューブリン抗体を1~100の割合で希釈した。
15,682回gで5分間の一次抗体遮断緩衝液の混合を遠心分離する。各ウェル内のブロッキング溶液を慎重に除去し、チューブから25〜50マイクロリットルの抗体ブロッキングバッファー上清を加えます。室温で暗闇の中で1時間インキュベートする。
次いで、各ウェルから抗体溶液を取り出し、1XPBSの100マイクロリットルで3回洗浄する。任意の追加の蛍光染色に加えて、推奨濃度でブロッキングバッファー内の二次抗体を希釈します。再度、2次抗体溶液を15、682回gで5分間遠心分離する。
各ウェルからブロッキング溶液を取り出し、2次抗体上清の25~50マイクロリットルを加える。暗闇の中で室温で1時間半インキュベートする。二次抗体色素溶液を取り除き、1X PBSで3回洗浄し、1ウェルあたり100マイクロリットルを洗浄します。
慎重にガラススライドの中央にプラスチック200マイクロリットルピペットで吸引することにより、個々のコラーゲンプラグを持ち上げます。コラーゲンプラグを覆うために適切なマウント剤を1滴追加します。サンプルの上にカバースリップを置き、暗い温度でスライドを保管します。
三次元スフェロイド技術は、がん特有の環境をより代表的にしているため、薬物と腫瘍の相互作用の理解を進めています。本研究では、潜在的な抗移動効果または遊遊覧効果が検出された。これは、コントロールまたは処理されたスフェロイドのいずれかで一見移行しないKNS42で特に顕著です。
細胞死は、10マイクロモルの最も高い阻害剤濃度で観察された。核の断片化と細胞の移動は、U251細胞で明らかであった。U251細胞スフェロイドは、元のスフェロイドから放射されるスパイクを有し、阻害剤濃度の増加に伴って明らかな細胞の細胞丸めが増加した。
KNS42では微小管の崩壊と核の断片化が見られた。単一セルスパイクを有するシート状突起は、KNS42の移行を示す。最も低いインヒビター濃度では、この表現型は顕著であったが、阻害剤濃度の増加とともに失われた。
準備ができるまで氷の上にすべての試薬を残することが重要です。それ以外の場合、コラーゲンは、すべてスフェロイドに添加される前に重合を開始します。細胞形態に対するmigrastatic薬の効果を評価するために、共焦点顕微鏡によって生成された画像を定量化する範囲がある。
初めて、ミグラスタティック阻害剤MI-192が微小管アセチル化レベルに及ぼす影響を確認し、細胞遊離の観点からさらにこれを探求することができました。固定工程でホルムアルデヒドを取り扱う際には、特別な注意が必要です。通常の安全衛生ガイドラインが適用されます。
