無細胞タンパク質合成は、タンパク質のインビトロ生産のためのシステムおよび合成生物学における新しい技術です。無細胞タンパク質合成システムは細胞壁を持たないため、代謝産物に直接アクセスできます。このプロトコルでは、中枢炭素およびエネルギー代謝に関与する40の代謝産物の絶対測定を定量化し、無細胞代謝を特徴付けることを可能にする。
このプロトコルは、アニリンを使用した化合物の転移に依存するため、より良い分離と質量分析の分解能が向上します。さらに、代謝物の絶対定量化のために、アニリンにラベルを付ける同位体を持つ内部標準を使用します。タグ付き代謝物は、鉄の抑制の効果を排除するコエルテを、します。
化合物の正確な定量化を可能にする。フードで作業し、550マイクロリットルのアニリンと337.5マイクロリットルのLC-MSグレードの水を組み合わせます。遠心分離管に12モル塩酸の112.5マイクロリットル。
ボルテックスウェル、およびpH 4.5と摂氏4度で6モルアニリン溶液を保存します。6モル炭素-13アニリン溶液を調製するには、pH 4.5で、炭素-13アニリンの250ミリグラムと132マイクロリットルの水と、12モル塩酸の44マイクロリットルを組み合わせます。ボルテックス井戸、摂氏4度で保管してください。
1 ミリリットル EDC 溶液あたり 200 ミリグラムを準備するには、 EDC の 2 ミリグラムを 10 マイクロリットルの水に溶解して、サンプルごとにタグ付けします。そして、よく渦。サンプルを調製するために、無細胞タンパク質合成反応でタンパク質をクエンチおよび沈殿させ、無細胞合成反応に等量の氷冷100%エタノールを添加することによって。
サンプルを12,000倍gで遠心し、摂氏4度で15分間遠心する。サンプルの上清を新しい遠心管に移します。炭素12アニリン溶液でサンプルをラベル付けするには、サンプルの6マイクロリットルを新しい遠心管に移し、水で体積を50マイクロリットルにします。
1ミリリットルのEDC溶液に200ミリグラムの5マイクロリットルを加え、炭素-12アニリン溶液をよく混ぜ、チューブに5マイクロリットルを移す。室温で2時間穏やかな揺れで反応を渦。2時間後、シェーカーからチューブを取り外し、ヒュームフードに移します。
各反応に1.5マイクロリットルのトリエチルアミンを加え、アニリンタグ付け反応を停止し、化合物を安定化させる。遠心分離機を13で、500回gで3分間行う。そして上清を保存します。
カーボン13アニリン溶液で内部標準をラベル付けするには、内部ストック溶液を50マイクロリットルの最終体積で80マイクロモルに希釈します。1ミリリットルEDC溶液あたり200ミリグラムの5マイクロリットル、およびよく混合された炭素13アニリン溶液の5マイクロリットルを加える。室温で2時間穏やかな揺れで反応を渦。
2時間後、シェーカーからチューブを取り出し、フュームフードの反応に1.5マイクロリットルのトリエチルアミンを加えます。遠心分離機で13、500回g3分間、上清を保存します。タグ付けされた内部標準とタグ付きサンプルを占うために、オートサンプラーバイアルにそれぞれ25マイクロリットルを混ぜます。
LC-MS手順で分析します。次に、タグなし代謝物の標準曲線を作成し、まず、50マイクロリットルの体積で、タグなし代謝物のストック溶液を異なる濃度に希釈する。1ミリリットルのEDC溶液に200ミリグラムの5マイクロリットルを加え、各濃度に炭素-12アニリン溶液を5マイクロリットル加えます。
室温で2時間穏やかな揺れで反応を渦。そしてトリエチルアミン処理を進める。以前のようにLC-MSで分析する前に遠心化。
LC-MSを初期化した後、メーカーの指示に従って、5マイクロリットルのサンプルをカラムに注入します。カーボン-12アニリンタグ付きサンプルに対する適切なmoverzイオン強度を取得する。次に、同じサンプルの5マイクロリットルを再び注入します。
カーボン-13アニリンタグ付き規格のmオーバーzイオン強度を取得します。このプロトコルでは、大腸菌系無細胞タンパク質合成において緑色蛍光タンパク質を発現する代謝産物を定量化した。中枢炭素およびエネルギー代謝に関与する40の代謝産物を、内部標準を用いて検出・定量した。
アニリンでタグ付けされなかった5つの代謝産物の標準曲線も開発されました。これらの経路に関与する多様な代謝産物は、リン酸化糖、ホスホカルボン酸、カルボン酸、ヌクレオチド、および共因子のクラスであった。さらに、この方法により、グルコース-6リン酸、フルクトース-6リン酸などの構造異性体対の分離が1回のLC-MSランで可能になった。
最も重要なステップは、非タンパク質化サンプルをアニリンで標識することです。アニリン溶液は分離するので、安全の良い慣行を維持しながら、迅速かつ効果的に作業することが重要です。この方法は、40の代謝産物の定量化と無細胞代謝を特徴付けるのに役立ちます。
しかし、その他の化合物は、定量化できるアミノ酸などの無細胞混合物中にある。これは、無細胞代謝のより包括的な外観を提供するのに役立ちます.この方法は、無細胞系は複雑な代謝を有することを明らかにした, まだより良いエネルギー効率と炭素収量のために利用することができる潜在的に利用することができる動作.
このプロトコルは、触媒としてEDCを使用してアニリンで化合物をタグ付けすることに依存しています。これらの試薬は危険であり、注意して使用する必要があります。
