細胞がタンパク質の恒常性を維持する方法は、細胞ストレスと老化の文脈ではよく理解されていません。このプロトコルでは、生細胞におけるタンパク質恒常性の重要な要素であるタンパク質代謝回転を計算するための簡単で正確な方法を提供します。Pulse SILACは、個々のタンパク質およびプロテオーム全体のタンパク質代謝回転をハイスループットな方法で測定する能力を実験者に提供しますが、これは他の方法よりも生物学的システムにとってより本物です。
この方法の原理は、生物全体を含む代謝的に標識することができる任意の系に適用することができる。この方法はまた、細胞老化、老化、および神経変性疾患への洞察をもたらし得る。質量分析分析は、洗剤などの特定の化学汚染物質に対して非常に敏感です。
この手順全体を通してLC-MSグレードの試薬を使用して、高品質のデータ収集を保証します。細胞の代謝標識を開始するには、老化細胞および静止期細胞のそれぞれ 3 つのプレートの培地を 30 ミリリットルの SILAC Light 培地と交換します。別途、3つの老化プレートと3つの静止プレート用の培地を30ミリリットルのSILAC Heavyと交換してください。
培地を交換せずに細胞を3日間増殖させる。培養プレートから細胞を剥離するために、予め加温したトリプシン試薬を各プレートに5ミリリットル加え、プレートを摂氏37度で5分間インキュベートする。その後、剥離した細胞を培養に用いた5ミリリットルの同じ培地に全量10ミリリットルまで再懸濁する。
次に、細胞を氷に移し、細胞を摂氏4度でGの300倍で遠心分離する。ペレットを2回洗浄した後、細胞を再びスピンダウンし、上清を除去してから、ペレットを150マイクロリットルの新しく調製した8モル尿素および50ミリモル重炭酸アンモニウム溶解緩衝液に再懸濁する。チューブの内容物を上下にピペッティングして混合します。
50マイクログラムのタンパク質サンプルを新しいチューブにアリコートし、溶解バッファーでサンプルを等量まで運びます。次いで、ジチオスレイトールを終濃度20ミリモルまでチューブに加え、試料を摂氏37度で振とうしながら30分間インキュベートする。サンプルを室温で10分間冷却してから、ヨードアセトアミドを終濃度40ミリモルに添加し、室温で暗所で30分間インキュベートする。
次いで、50ミリモルの炭酸水素アンモニウム緩衝液で試料を1モル以下の尿素に希釈する。50マイクログラムの開始タンパク質に対して1マイクログラムのトリプシンを加えるか、または1:50のトリプシン対タンパク質比でサンプルに加える。サンプルを摂氏37度で一晩振とうしながらインキュベートし、タンパク質をペプチドに消化します。
翌日、ギ酸をサンプルの1体積%に加え、タンパク質消化をクエンチする。サンプルのクリーンアップでは、製造元のガイドラインに従って、サンプルごとに 1 つの抽出カートリッジを使用して、真空マニホールド上に固相抽出カートリッジを置きます。抽出後、真空マニホールドからペプチドサンプルを取り出し、真空濃縮器で完全に乾燥させます。
乾燥には約3時間かかります。質量分析またはMS分析のために、0.2%ギ酸緩衝液中に1マイクロリットルあたり400ナノグラムの濃度でペプチドサンプルを再懸濁する。ペプチドを再可溶化するために、サンプルを5分間混合する。
その後、水浴超音波処理機で5分間超音波処理する。次いで、サンプルを遠心分離して不溶性物質をペレット化し、ペプチド上清をMSバイアルに移す。液体クロマトグラフィータンデム質量分析法 (LC-MS-MS) を使用してプロテオーム分析用のサンプルを提出します。
質量分析施設による非ターゲット分析に推奨される設定を使用します。毎分400ナノリットルの流速でサンプルを分析カラムにロードし、有機溶媒と無機溶媒の混合物を使用して90分間の直線勾配でペプチドを溶出させ、有機溶媒は5〜35%の範囲で、MS1サーベイスキャンの連続サイクルに続いてHCDフラグメンテーションを伴う20のデータ依存MS2スキャンが続くデータ依存モードで質量分析データを取得します。プロテオーム定量ソフトウェアツールで重ペプチドと軽質ペプチドのペプチドピーク面積を定量します。
次に、重くて軽いペプチドピーク領域をエクスポートします。タンパク質の半減期を計算するには、SILAC 解析ワークブックを Raw Data という名前の最初のシートに開き、UniProt ID、遺伝子名、重いピーク領域と軽いピーク領域を指示された列に貼り付けます。次に、「分析」という名前の 4 番目のシートを開き、列 G と列 H がサンプルが範囲外であることを示す行を削除し、読み取り対象の行を範囲内に保ちます。
老化表現型を、老化関連β-ガラクトシダーゼ活性およびRT-qPCR分析を用いて検証した。β-ガラクトシダーゼ活性については、老化細胞は青色に見えたが、静止期対照細胞は色が全くないか、または最小色であった。RT-qPCR解析では、老化細胞は静止細胞と比較して高いインターロイキン-6、CXCL8、およびCDKN1A-P21 mRNAを示した。
逆に、増殖マーカーをコードするラミンB1のレベルは、老化細胞において低かったか、または存在しなかった。抽出されたペプチドのイオンクロマトグラムは、重ペプチドシグナルと軽ペプチドシグナルの相対比率を明らかにした。軽い老化細胞と比較して重いペプチドシグナルの割合が低いほどタンパク質代謝回転速度が遅くなり、軽い細胞に対して重いペプチドシグナルが高いほどタンパク質代謝回転速度が速いことが示されました。
標識されていないサンプルは、重いペプチドシグナルをほとんどまたはまったく示さなかった。質量分析分析から同定された695タンパク質についての半減期を計算した。半減期は、静止状態の細胞に対する老化の対数2比として報告され、火山プロットにプロットされる。
老化細胞におけるタンパク質代謝回転率の計算に続いて、下流の解析により、タンパク質形成機構によって調節される候補生物学的経路が明らかにされ得る。Pulse SILACは、研究者が前例のない粒度とスループットでタンパク質ダイナミクスを研究する道を開き、多くの個々のタンパク質におけるタンパク質恒常性の変化を研究することを可能にしました。
