Lo sviluppo di strumenti selettivi di somministrazione di geni e farmaci per trattare i disturbi neurodegenerativi, richiede la quantificazione e la caratterizzazione del targeting cellulare, sulla ri-somministrazione, o vettori virali, o nanoparticelle. Hanno capacità di produttività e multiplexing della citometria del flusso, consentono l'identificazione diretta e simultanea di più tipi di cellule dal cervello del topo e dal midollo spinale. A dimostrare la procedura sarà Francisco Javier Molina Estevez, un post-doc del Laboratorio di Alexander.
Dopo aver raccolto il cervello e il midollo spinale da un topo C57 Black 6 di otto settimane, posizionare i tessuti in singoli pozzi di una piastra di sei poggiapolsi, contenente due millilitri di HPSS ghiacciato per pozzo sul ghiaccio. Dividere ogni tessuto raccolto in due pezzi uguali. E usa le forbici per tritare la metà di ogni campione di tessuto in pezzi spessi da uno a due millimetri.
Quando tutti i tessuti sono stati frammentati, pre-sciacquare una punta di pipetta da 1.000 microliter modificata in HPSS e utilizzare la pipetta per trasferire ogni sospensione tissutale in singoli tubi conici da 15 millilitri. Risciacquare i pozzi con altri due millilitri di HPSS per pozzo. E tirare i lavaggi nei corrispondenti tubi conici da 15 millilitri.
Sedimentare i campioni per centrifugazione. E mescolare 50 microlitri dell'enzima P da un kit di dissociazione del tessuto neurale con 1.900 microlitri di Buffer X dal kit per campione. Riscaldare la miscela enzimatica a 37 gradi celsius per almeno 10 minuti.
E aspira il supernatante da ogni tubo di raccolta tissutale. Quando la miscela enzimatica è pronta, aggiungere 1,95 millilitri della soluzione a ciascun campione. E delicatamente vortice per sospendere di nuovo i pellet.
Successivamente, incubare i campioni su una ruota per 15 minuti a 37 gradi celsius e mescolare 10 microlitri dell'enzima A con 20 microlitri di Buffer Y per campione. Prewarm la seconda soluzione enzimatica a 37 gradi celsius, prima di aggiungere 30 microlitri della soluzione a ciascuna soluzione tissutale alla fine dell'incubazione di scuotimento. Utilizzare una punta di pipetta da 1.000 microliter, preriacquata con HPSS per mescolare delicatamente ogni campione.
E riportare gli esemplari al volante per 15 minuti a 37 gradi celsius. Al termine dell'incubazione, arrestare le reazioni enzimatiche con 10 millilitri di HPSS ghiacciato. E sedimentare i campioni per centrifugazione.
Al termine della centrifugazione, sospendere di nuovo i pellet in sette millilitri di HPSS ghiacciato per tubo. E vortice delicatamente ogni campione, prima di tenere i tubi sul ghiaccio. Per l'omogeneizzazione dei tessuti, aggiungere tre millilitri di HPSS pre-refrigerato alla malta di vetro pre-refrigerata di una smerigliatrice di tessuto dounce e trasferire la seconda metà di uno dei campioni di tessuto cerebrale o del midollo spinale raccolti alla malta.
Macerare delicatamente il tessuto con 10 colpi di Pestle A, seguito da 10 colpi di Pestle B.E trasferire la miscela omogeneizzata in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Riempire il tubo con un volume finale di 10 millilitri con HPSS pre-refrigerato per la centrifugazione. E sospendere di nuovo il pellet in sette millilitri di HPSS fresco con vortice, prima di tenere il campione sul ghiaccio.
Per la rimozione dei detriti, aggiungere tre millilitri di soluzione isotonica Percoll pre-refrigerata a ciascun campione digerito o omogeneizzato. E vortice delicatamente i campioni per assicurarsi che siano miscelati in modo omogeneo. Quindi, centrifugare i campioni e rimuovere con cura il disco biancastro di detriti e mielina che galleggiano sulla superficie della soluzione.
Quando i detriti sono stati scartati, raccogliere tutti gli ultimi 100 microlitri del supernatante da ogni tubo senza disturbare il pellet. Sospendere di nuovo ogni pellet in un millilitro di soluzione FACS BL per il trasferimento in singoli tubi a microcentrifugo da 1,5 millilitri. Dopo questa integrazione con la soluzione Percoll, è importante rimuovere il disco detritico e il supernatante con molta attenzione senza scollare il pellet cellulare per evitare la perdita del campione.
Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il supernatante da ogni tubo e sospendere di nuovo i pellet in 350 microlitri di FACS BL fresco per tubo. Per l'analisi citometrica del flusso dei tipi di cellule isolate, incubare i campioni con cinque microgrammi per millilitro di blocco FC per tubo per 10 minuti a quattro gradi celsius prima di aggiungere l'anticorpo appropriato a ciascun tubo secondo il protocollo permanente delineato nella tabella. Vortice ogni tubo per cinque secondi da mescolare.
E posizionare i campioni a quattro gradi Celsius per 15 minuti protetti dalla luce. Alla fine dell'incubazione, lavare i campioni con un millilitro di PBS per tubo e centrifugare. Sospendere di nuovo i pellet nel volume appropriato di streptavidina per tubo.
Dopo aver vortice da mescolare, incubare i campioni per 10 minuti a quattro gradi Celsius protetti dalla luce. E lavare le cellule con un millilitro di PBS per tubo come dimostrato. Dopo aver scartato i supernaganti, sospendere di nuovo i pellet in 300 microlitri di FACS BL fresco per tubo.
Ed etichettare ogni campione con cinque microlitri di 7-AAD. Quindi conservare i campioni a quattro gradi celsius protetti dalla luce fino all'analisi citofluorometrica. Il metodo di omogeneizzazione produce una maggiore resa cellulare sia dal cervello che dal midollo spinale in generale, ma la maggior parte delle cellule recuperate sono tipicamente morte, risultando solo e circa il 14% guarito da cellule vitali dal cervello e circa il 10% guarito dal midollo spinale.
Al contrario, il metodo di digestione della papaina si traduce in una migliore conservazione generale della vitalità cellulare. L'analisi delle sospensioni cerebrali e cellulari del midollo spinale con una citometria bi-flusso a nove colori, rivela la presenza di CD45+CD11b+microglia e macrofagi. E i linfociti CD45+CD11b in entrambi i tessuti.
Le popolazioni di cellule CD45 possono quindi essere discriminate in base alla loro positività per gli astrociti, o marcatori oligodendrociti, o espressione ferionale ed endoteliale del marcatore superficiale. Utilizzando il metodo di omogeneizzazione, tra il 32 e il 38% delle cellule vitali sono di origine ematopoietica. Mentre il metodo di digestione enzimatica si traduce nell'acquisizione di una frazione molto grande di cellule CD45 non ematopoietiche.
Sorprendentemente, CD45+CD11b+microglia e macrofagi rappresentano la frazione cellulare vitale più abbondante con il metodo di omogeneizzazione. Il metodo di digestione, tuttavia, produce una rappresentazione più eterogenea dei tipi cellulari tra cui astrociti, oligodendrociti, cellule endoteliali e neuroni. Questo protocollo è versatile e potrebbe essere sfruttato per diverse applicazioni downstream come la quantificazione o l'isolamento di sottopopolazioni di cellule specifiche, coltura primaria o biochimica, o analisi di sequenziamento dell'RNA.
Abbiamo implementato questo protocollo per valutare l'espressione genica e le firme funzionali di diverse popolazioni del SNC durante questa progressione, o dopo il trattamento in un modello di topo di sclerosi laterale endotrofica.
