Nörodejeneratif bozuklukları tedavi etmek için seçici gen ve ilaç dağıtım araçlarının geliştirilmesi, yeniden yönetim üzerine, hücre hedefleme nicelleştirme ve karakterizasyon gerektirir, veya viral vektörler, ya da nano tanecikleri. Onlar akış sitometri üretim ve multiplexing yetenekleri var, fare beyin ve omurilik birden fazla hücre türlerinin basit ve eşzamanlı kimlik sağlar. Prosedürü gösteren Francisco Javier Molina Estevez, Alexander's Laboratory bir post-doc olacaktır.
Sekiz haftalık C57 Black 6 fareden beyin ve omurilik hasat sonra, buz üzerinde iyi başına buz soğuk HPSS iki mililitre içeren, altı iyi plaka bireysel kuyular içine dokuları yerleştirin. Her hasat edilen dokuyu iki eşit parçaya bölün. Ve bir ila iki milimetre kalınlığında parçalar halinde her doku örneğinin bir yarısını kıyma makas kullanın.
Tüm dokular parçalandığında, HPSS'de değiştirilmiş 1.000 mikrolitrelik pipet ucunu önceden durulayın ve her doku süspansiyonunun tek tek 15 mililitrelik konik tüplere aktarılması için pipetkullanın. Kuyuları her kuyuda iki mililitre HPSS ile durula. Ve ilgili 15 mililitrelik konik tüpler de yıkın.
Numuneleri santrifüj ile tortulat. Ve bir nöral doku dissosyasyon kitinden 50 mikrolitre Enzim P'yi numune başına kitten 1,900 mikrolitre Tampon X ile karıştırın. Enzim karışımını en az 10 dakika boyunca 37 derecede ısıtın.
Ve her doku toplama tüpünden süpernatant aspire. Enzim karışımı hazır olduğunda, her numuneye çözeltinin 1,95 mililitresini ekleyin. Ve peletleri yeniden askıya almak için yavaşça girdap.
Daha sonra, numuneleri bir tekerlek üzerinde 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve 10 mikrolitre A Enzimini numune başına 20 mikrolitre Tampon Y ile karıştırın. Sallayarak kuluçka sonunda her doku çözeltisi için çözelti 30 mikrolitre eklemeden önce, 37 santigrat derece ikinci enzim çözeltisi önceden ısıtın. Her numuneyi hafifçe karıştırmak için HPSS ile önceden durulanmış 1.000 mikrolitrelik pipet ucu kullanın.
Ve numuneleri 37 derecede 15 dakika boyunca tekerleğe geri götürün. Kuluçka sonunda, buz gibi HPSS 10 mililitre ile enzimatik reaksiyonlar tutuklamak. Ve numuneleri santrifüj le tortula.
Santrifüjün sonunda, tüp başına yedi mililitre buz gibi HPSS peletleri yeniden askıya alın. Ve tüpleri buzda tutmadan önce her numuneyi yavaşça girdaplayın. Doku homojenizasyonu için, bir dounce doku öğütücü önceden soğutulmuş cam harç için önceden soğutulmuş HPSS üç mililitre ekleyin ve toplanmış beyin veya omurilik dokusu örneklerinden birinin ikinci yarısını harç aktarın.
Yavaşça Pestle A 10 vuruş ile doku macerate, Pestle B.10 vuruş takip ve yeni bir 15 mililitre konik tüp içine homojenize karışımı transfer. Tüpü, santrifüj için önceden soğutulmuş HPSS ile 10 mililitrelik son bir hacimle doldurun. Ve numuneyi buzda tutmadan önce, yedi mililitre taze HPSS'de girdap ile peleti yeniden askıya alın.
Enkaz kaldırma için, her sindirilmiş veya homojenize örnek için önceden soğutulmuş İzotonik Percoll çözeltisi üç mililitre ekleyin. Ve homojen bir şekilde karıştırıldığından emin olmak için numuneleri yavaşça girdaplayın. Daha sonra, numuneleri santrifüj edin ve çözeltinin yüzeyinde yüzen enkaz ve miyelinin beyazımsı diskini dikkatlice çıkarın.
Enkaz atıldığında, peletrahatsız olmadan her tüpten supernatant son 100 mikrolitre hariç tüm toplamak. Tek tek 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplere aktarmak için bir mililitre FACS BL çözeltisi içinde her peleti yeniden askıya alın. Percoll çözeltisi ile bu entegrasyondan sonra, numune kaybını önlemek için hücre peletini çıkarmadan enkaz diskini ve süpernatantı çok dikkatli bir şekilde çıkarmak önemlidir.
Santrifüjden sonra, her tüpten süpernatantı dikkatlice aspire edin ve tüp başına 350 mikrolitre taze FACS BL peletleri yeniden askıya alın. İzole hücre tiplerinin akış sitometrik analizi için, tabloda belirtilen protokole göre her tüpe uygun antikor eklemeden önce numuneleri tüp başına mililitre başına beş mikrogram fc bloğu ile 10 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Girdap her tüp karışımı için beş saniye.
Ve örnekleri ışıktan korunan 15 dakika boyunca 4 derece yedirin. Kuluçka sonunda, tüp başına pbs bir mililitre ile örnekleri yıkayın, ve santrifüj. Tüp başına streptavidin uygun hacimde peletyeniden askıya.
Karıştırmak için girdap sonra, ışıktan korunan dört derece santigrat 10 dakika boyunca örnekleri kuluçka. Ve gösterildiği gibi tüp başına pbs bir mililitre ile hücreleri yıkayın. Supernatants attıktan sonra, tüp başına taze FACS BL 300 mikrolitre pelet yeniden askıya.
Ve her numuneyi 5 mikrolitre 7-AAD ile etiketle. Daha sonra numuneleri ışıktan korunan dört santigrat derecede sitoflorometrik analize kadar saklayın. Homojenizasyon yöntemi genel olarak hem beyin hem de omurilikten daha yüksek bir hücre verimi üretir, ancak alınan hücrelerin çoğu tipik olarak ölüdür, bu da sadece ve beyinden canlı hücrelerin yaklaşık %14'ünün iyileşmesi ve yaklaşık %10'unun omurilikten iyileşmesi ile sonuçlanır.
Buna karşılık, papain sindirim yöntemi hücresel canlılık genel olarak daha iyi korunması ile sonuçlanır. Dokuz renkli bi-akış sitometri ile beyin ve omurilik hücresi süspansiyonlarının analizi, CD45+CD11b+microglia ve makrofajların varlığını ortaya koymaktadır. Ve her iki dokuda CD45+CD11b-lenfositler.
CD45 hücreli popülasyonlar daha sonra astrosit, ya da oligodendrosit belirteçleri, ya da feriyonal ve endotel yüzey belirteç ifade için kendi pozitifliğine göre ayırt edilebilir. Homojenizasyon yöntemi kullanılarak canlı hücrelerin %32 ila %38'i hematopoetik kökenlidir. Enzimatik sindirim yöntemi hematopoetik olmayan CD45 hücrelerinin çok büyük bir kısmının alınmasıyla sonuçlanırken.
Dikkat çekici bir şekilde, CD45+CD11b+mikroglia ve makrofajlar homojenizasyon yöntemi ile en bol canlı hücre fraksiyonunu temsil eder. Sindirim yöntemi, ancak, astrositler de dahil olmak üzere hücre tiplerinin daha heterojen bir temsil üretir, oligodendrositler, endotel hücreleri, ve nöronlar. Bu protokol çok yönlüdür ve belirli hücre alt popülasyonlarının niceleifikasyonu veya izolasyonu, birincil kültür veya biyokimyasal veya RNA sıralama analizi gibi çeşitli alt akım uygulamaları için kullanılabilir.
Bu ilerleme sırasında veya endotrofik lateral sklerozun fare modelinde tedavi sonrası farklı CNS popülasyonlarının gen ekspresyonunu ve fonksiyonel imzalarını değerlendirmek için bu protokolü uyguladık.
