O desenvolvimento de ferramentas seletivas de entrega de genes e medicamentos para tratar os distúrbios neurodegenerativos requer a quantificação e caracterização do direcionamento celular, mediante re-administração, ou vetores virais, ou nanopartículas. Eles têm capacidades de rendimento e multiplexação da citometria de fluxo, permite a identificação direta e simultânea de vários tipos celulares do cérebro do camundongo e da medula espinhal. Demonstrando o procedimento estará Francisco Javier Molina Estevez, um pós-doutor do Laboratório de Alexandre.
Depois de colher o cérebro e a medula espinhal de um rato C57 Black 6 de oito semanas de idade, coloque os tecidos em poços individuais de uma placa de seis poços, contendo dois mililitros de HPSS gelado por poço no gelo. Divida cada tecido colhido em dois pedaços iguais. E use uma tesoura para cortar metade de cada amostra de tecido em pedaços de um a dois milímetros de espessura.
Quando todos os tecidos tiverem sido fragmentados, pré-enxague uma ponta de pipeta modificada de 1.000 microliter no HPSS, e use a pipeta para transferir cada suspensão de tecido para tubos cônicos individuais de 15 mililitros. Enxágüe os poços com mais dois mililitros de HPSS por poço. E puxe as lavagens nos tubos cônicos correspondentes de 15 mililitros.
Sedimentar as amostras por centrifugação. E misture 50 microliters de Enzima P de um kit de dissociação de tecido neural com 1.900 microliters de Buffer X do kit por amostra. Aqueça a mistura de enzimas a 37 graus celsius por pelo menos 10 minutos.
E aspirar o supernaente de cada tubo de coleta de tecido. Quando a mistura de enzimas estiver pronta, adicione 1,95 mililitros da solução a cada amostra. E gentilmente vórtice para suspender as pelotas.
Em seguida, incubar as amostras em uma roda por 15 minutos a 37 graus celsius, e misturar 10 microliters de Enzima A com 20 microliters de Buffer Y por amostra. Pré-intensimar a segunda solução enzimácula a 37 graus celsius, antes de adicionar 30 microliters da solução a cada solução de tecido no final da incubação de agitação. Use uma ponta de pipeta de 1.000 microliter, pré-enxaguada com HPSS para misturar suavemente cada amostra.
E devolva os espécimes ao volante por 15 minutos a 37 graus celsius. No final da incubação, prendam as reações enzimáticas com 10 mililitros de HPSS gelado. E sedimentar as amostras por centrifugação.
No final da centrifugação, suspenda as pelotas em sete mililitros de HPSS gelado por tubo. E suavemente vórtice cada amostra, antes de segurar os tubos no gelo. Para homogeneização tecidual, adicione três mililitros de HPSS pré-refrigerados à argamassa de vidro pré-refrigerado de um moedor de tecido dounce, e transfira a segunda metade de uma das amostras de tecido cerebral ou medula espinhal colhidas para a argamassa.
Macerar suavemente o tecido com 10 traços de Pilo A, seguido por 10 golpes de Pilão B.E transferir a mistura homogeneizada para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Encha o tubo a um volume final de 10 mililitros com HPSS pré-refrigerado para centrifugação. E suspenda a pelota em sete mililitros de HPSS frescos com vórtice, antes de segurar a amostra no gelo.
Para a remoção dos detritos, adicione três mililitros de solução isotônica percoll pré-refrigerada a cada amostra digerida ou homogeneizada. E suavemente vórtice as amostras para ter certeza de que são homogeneamente misturadas. Em seguida, centrifufique as amostras, e remova cuidadosamente o disco esbranquiçado de detritos e mielina flutuando na superfície da solução.
Quando os destroços foram descartados, colete todos, exceto os últimos 100 microlitres do supernatante de cada tubo sem perturbar as pelotas. Suspenda-se cada pelota em um mililitro da solução FACS BL para transferência em tubos individuais de microcentrífugo de 1,5 mililitro. Após essa integração com a solução Percoll, é importante remover o disco de detritos e o sobrenante com muito cuidado sem desalojar a pelota celular para evitar a perda de amostras.
Após a centrifugação, aspire cuidadosamente o supernascer de cada tubo, e suspenda as pelotas em 350 microliters de FACS BL fresco por tubo. Para análise citométrica de fluxo dos tipos celulares isolados, incubar as amostras com cinco microgramas por mililitro de bloco FC por tubo por 10 minutos a quatro graus celsius antes de adicionar o anticorpo apropriado a cada tubo de acordo com o protocolo permanente descrito na tabela. Vórtice cada tubo por cinco segundos para misturar.
E coloque as amostras a 4 graus celsius por 15 minutos protegidas da luz. No final da incubação, lave as amostras com um mililitro de PBS por tubo e centrífuga. Suspenda-as demais as pelotas no volume apropriado de streptavidina por tubo.
Após o vórtice para misturar, incubar as amostras por 10 minutos a quatro graus celsius protegidos da luz. E lave as células com um mililitro de PBS por tubo, como demonstrado. Depois de descartar os supernantes, suspenda as pelotas em 300 microliters de FACS BL frescos por tubo.
E rotule cada amostra com cinco microliters de 7-AAD. Em seguida, armazene as amostras a quatro graus celsius protegidos da luz até a análise citofluormétrica. O método de homogeneização produz um maior rendimento celular do cérebro e da medula espinhal no geral, mas a maioria das células recuperadas estão tipicamente mortas, resultando apenas em 14% curados de células viáveis do cérebro, e aproximadamente 10% curados da medula espinhal.
Em contrapartida, o método de digestão papain resulta em uma melhor preservação geral da viabilidade celular. A análise das suspensões de células cerebrais e medulares com uma citometria bi-fluxo de nove cores, revela a presença de CD45+CD11b+microglia, e macrófagos. E cd45+CD11b-linfócitos em ambos os tecidos.
As populações de células CD45 podem então ser discriminadas de acordo com sua positividade para marcadores de astrocito, ou oligodendrocyte, ou expressão de marcador de superfície ferional e endotelial. Utilizando o método de homogeneização, entre 32 a 38% das células viáveis são de origem hematopoiética. Enquanto o método de digestão enzimática resulta na aquisição de uma fração muito grande de células CD45 não hematopoiéticas.
Notavelmente, CD45+CD11b+microglia e macrófagos representam a fração celular viável mais abundante com o método de homogeneização. O método de digestão, no entanto, produz uma representação mais heterogênea de tipos celulares, incluindo astrócitos, oligodendrócitos, células endoteliais e neurônios. Este protocolo é versátil e pode ser explorado para várias aplicações a jusante, como quantificação ou isolamento de subpopulações de células específicas, cultura primária ou análise bioquímica ou sequenciamento de RNA.
Implementamos este protocolo para avaliar a expressão genética e assinaturas funcionais de diferentes populações de SNC durante essa progressão, ou após o tratamento em um modelo de camundongos de esclerose lateral endotrófica.
