Die Entwicklung selektiver Gen- und Medikamentenabgabeinstrumente zur Behandlung neurodegenerativer Störungen erfordert die Quantifizierung und Charakterisierung von Zellzielen, nach Re-Administration, oder viralen Vektoren oder Nanopartikeln. Sie verfügen über Durchsatz- und Multiplexing-Fähigkeiten der Durchflusszytometrie, ermöglicht die einfache und gleichzeitige Identifizierung mehrerer Zelltypen aus dem Mausgehirn und Rückenmark. Demonstriert wird das Verfahren von Francisco Javier Molina Estevez, einem Post-Doc von Alexander es Laboratory.
Nach der Ernte des Gehirns und des Rückenmarks aus einer acht Wochen alten C57 Black 6 Maus, legen Sie das Gewebe in einzelne Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte, die zwei Milliliter eiskalte HPSS pro Brunnen auf Eis enthält. Teilen Sie jedes geerntete Gewebe in zwei gleiche Stücke. Und verwenden Sie eine Schere, um die Hälfte jeder Gewebeprobe in ein bis zwei Millimeter dicke Stücke zu zerkleinern.
Wenn alle Gewebe fragmentiert sind, spülen Sie eine modifizierte 1.000 Mikroliter Pipettenspitze in HPSS vor und verwenden Sie die Pipette, um jede Gewebesuspension in einzelne 15 Milliliter konische Röhren zu übertragen. Spülen Sie die Brunnen mit zusätzlichen zwei MilliliterN HPSS pro Brunnen. Und ziehen Sie die Wässen in die entsprechenden 15 Milliliter konischen Rohre.
Sedimentieren Sie die Proben durch Zentrifugation. Und mischen Sie 50 Mikroliter Enzym P aus einem Neuronalgewebe Dissoziationskit mit 1, 900 Mikroliter Puffer X aus dem Kit pro Probe. Die Enzymmischung bei 37 Grad Celsius mindestens 10 Minuten erwärmen.
Und aspirieren Sie den Überstand aus jedem Gewebesammelrohr. Wenn das Enzymgemisch fertig ist, fügen Sie 1,95 Milliliter der Lösung zu jeder Probe hinzu. Und sanft Wirbel, um die Pellets wieder aufzuhängen.
Als nächstes die Proben auf einem Rad für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren und 10 Mikroliter Enzym A mit 20 Mikroliter Puffer Y pro Probe mischen. Die zweite Enzymlösung bei 37 Grad Celsius vorwärmen, bevor sie am Ende der Schüttelinkubation 30 Mikroliter der Lösung zu jeder Gewebelösung hinzufügt. Verwenden Sie eine 1.000 Mikroliter Pipettenspitze, vorspült mit HPSS, um jede Probe sanft zu mischen.
Und bringen Sie die Exemplare für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius ans Rad zurück. Am Ende der Inkubation, halten Sie die enzymatischen Reaktionen mit 10 Milliliter eiskalteHPSS. Und Sediment die Proben durch Zentrifugation.
Am Ende der Zentrifugation die Pellets in sieben Millilitere eiskalte HPSS pro Röhre wieder aufhängen. Und sanft wirbeln jede Probe, bevor sie die Rohre auf Eis. Zur Gewebehomogenisierung drei Milliliter vorgekühlter HPSS in den vorgekühlten Glasmörtel eines Deunzelteilschleifers geben und die zweite Hälfte einer der geernteten Hirn- oder Rückenmarksgewebeproben auf den Mörtel übertragen.
Das Gewebe vorsichtig mit 10 Strichen von Pestle A mazerieren, gefolgt von 10 Schlägen Pestle B. Und übertragen Sie die homogenisierte Mischung in ein neues 15 Milliliter konisches Rohr. Füllen Sie das Rohr auf ein Endvolumen von 10 Millilitern mit vorgekühlten HPSS für die Zentrifugation. Und setzen Sie das Pellet in sieben Milliliter frisches HPSS mit Wirbel wieder auf, bevor Sie die Probe auf Eis halten.
Zur Entfernung von Schmutz drei Milliliter vorgekühlter isotonischer Percoll-Lösung zu jeder verdauten oder homogenisierten Probe hinzufügen. Und die Proben sanft wirbeln, um sicherzustellen, dass sie homogen gemischt werden. Als nächstes zentrifugieren Sie die Proben und entfernen Sie vorsichtig die weißliche Scheibe von Schmutz und Myelin, das an der Oberfläche der Lösung schwebt.
Wenn die Trümmer entsorgt wurden, sammeln Sie alle bis auf die letzten 100 Mikroliter des Überstandes aus jedem Rohr, ohne die Pellets zu stören. Setzen Sie jedes Pellet in einem Milliliter FACS BL-Lösung für den Transfer in einzelne 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohre wieder auf. Nach dieser Integration mit der Percoll-Lösung ist es wichtig, die Trümmerscheibe und den Überstand sehr sorgfältig zu entfernen, ohne das Zellpellet zu entfernen, um Probenverlust zu vermeiden.
Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig aus jedem Rohr ansaugen und die Pellets in 350 Mikrolitern frischer FACS BL pro Tube wieder aufhängen. Für die zytometrische Durchflussanalyse der isolierten Zelltypen die Proben mit fünf Mikrogramm pro Milliliter FC-Block pro Rohr für 10 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren, bevor Sie jedem Rohr gemäß dem in der Tabelle beschriebenen stehenden Protokoll den entsprechenden Antikörper hinzufügen. Wirbel jede Röhre für fünf Sekunden zu mischen.
Und legen Sie die Proben bei vier Grad Celsius für 15 Minuten vor Licht geschützt. Am Ende der Inkubation die Proben mit einem Milliliter PBS pro Tube und Zentrifuge waschen. Die Pellets in dem entsprechenden Volumen von Streptavidin pro Röhre wieder aufhängen.
Nach dem Wirbeln zu mischen, inkubieren Sie die Proben für 10 Minuten bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt. Und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter PBS pro Tube, wie gezeigt. Nach dem Wegwerfen der Überräube, setzen Sie die Pellets in 300 Mikroliter frischer FACS BL pro Tube wieder auf.
Und beschriften Sie jede Probe mit fünf Mikroliter 7-AAD. Dann lagern Sie die Proben bei vier Grad Celsius geschützt vor Licht bis zur zytofluorometrischen Analyse. Die Homogenisierungsmethode erzeugt eine höhere Zellausbeute sowohl aus dem Gehirn als auch vom Rückenmark insgesamt, aber die Mehrheit der entnommenen Zellen ist in der Regel tot, was nur zu etwa 14% verheilbaren lebensfähigen Zellen aus dem Gehirn und etwa 10% aus dem Rückenmark geheilt wird.
Im Gegensatz dazu führt die Papain-Verdauungsmethode zu einer insgesamt besseren Erhaltung der zellulären Lebensfähigkeit. Die Analyse der Suspensionen des Gehirns und der Rückenmarkszellen mit einer neunfarbigen Bi-Flow-Zytometrie zeigt das Vorhandensein von CD45+CD11b+Mikroglia und Makrophagen. Und CD45+CD11b-Lymphozyten in beiden Geweben.
Die CD45-Zellpopulationen können dann entsprechend ihrer Positivität für Astrozyten- oder Oligodendrozytenmarker oder ferionale und endotheliale Oberflächenmarker-Expression diskriminiert werden. Mit der Homogenisierungsmethode sind zwischen 32 und 38% der lebensfähigen Zellen hämatopoetischen Ursprungs. Während die enzymatische Verdauungsmethode zur Erfassung eines sehr großen Anteils einer nicht-hämatopoetischen CD45-Zellen führt.
Bemerkenswert ist, dass CD45+CD11b+Mikroglia und Makrophagen mit der Homogenisierungsmethode die am häufigsten vorhandene lebensfähige Zellfraktion darstellen. Die Verdauungsmethode erzeugt jedoch eine heterogenere Darstellung von Zelltypen, einschließlich Astrozyten, Oligodendrozyten, Endothelzellen und Neuronen. Dieses Protokoll ist vielseitig und könnte für mehrere nachgelagerte Anwendungen wie die Quantifizierung oder Isolierung bestimmter Zellsubpopulationen, Primärkultur oder biochemische oder RNA-Sequenzierungsanalyse genutzt werden.
Wir haben dieses Protokoll implementiert, um die Genexpression und funktionelle Signaturen verschiedener ZNS-Populationen während dieser Progression oder nach der Behandlung in einem Mausmodell der endotrophen Lateralsklerose zu bewerten.
