当社のジェノタイピングプロトコルの主な利点は、ホルマリン固定のパラフィン埋め込みモル組織をジェノタイピングする際の主な課題である母体DNAとの汚染を最小限に抑える点です。フローサイトメトリーは、ヒダチジフォームのモルの診断を大幅に容易にする高速かつ安価な方法です。ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)の各受胎物については、顕微鏡による形態学的評価のために、このビデオで詳述されているように、4ミクロンの厚いヘマトキシリンおよびエオシン染色セクションを準備する。
FFPEブロックを氷の上に15分間置き、断面化を容易にします。顕微鏡形態評価のために4ミクロンの厚さのセクションをカットするようにミクロトームを調整します。コールドブロックをミクロトームに入れ、H&E染色のために各ブロックから1つのセクションを切ります。
鉗子を使用して、各セクションを摂氏45度の水浴に移します。以前に鉛筆を使用してサンプル識別番号でラベル付けされた正に帯電したスライドで、ウォーターバスからセクションをピックアップします。セクションを含むスライドをオーブンに65°Cで置き、セクションをスライドに付着させます。
スライドをオーブンに25分間保管します。テキスト プロトコルで表された正しい期間、適切な染色瓶にスライドをサブマージして H&E 染色を実行します。取り付け媒体と形態学的分析のための4ミクロンセクションを取り付けます。
そして、ガラスカバースリップで覆います。H&Eスライドと軽顕微鏡を使用して、絨毛絨毛の最多量を有するFFPEブロックを選択します。そして、可能であれば、絨毛性絨毛を持つブロックは、母親の組織とは分離し、混ざり合っていない。
DNA抽出のために10ミクロンの厚さのセクションをカットするようにミクロトームを調整します。ブロック内の絨毛絨毛の量に応じて、10〜30のセクションをカットします。以前のようにスライドでセクションをピックアップした後、セクションがスライドに付着できるように、65°Cでオーブンにセクションを含むスライドを配置します。
スライドをオーブンに20分間保管します。テキスト プロトコルで表された正しい期間、適切な染色瓶にスライドをサブマージして H&E 染色を実行します。有毒なキシレン臭が消散するために、最低3時間は煙のフードの下にスライドを残します。
鉗子を使用して、湿らせた紙の拭き取りから小さな紙を引き裂きます。軽いステレオ顕微鏡の下で、鉗子と水を湿らせた紙のワイプの小片を使用して、H&E染色10ミクロンの厚いセクションから不要なすべての母体組織を削り取ります。このステップの鍵は、特に挑戦的なブロックのための忍耐です。
また、母親の組織が見逃されないように、他の誰かに目を向けしてもらうことも重要です。今、湿らせた紙のワイプから新しい紙を引き裂き、絨毛性絨毛を収集するためにそれを使用します。付属の絨毛絨毛絨毛を入れた紙の拭き取りを1.5mlチューブに入れ。
このステップで使用される紙のワイプの量を最小限に抑え、DNA抽出カラムを詰まらせ、結果的に収集されたDNAの最終的な量を減らします。FFPEキットからのDNA抽出プロトコルに従って、DNA抽出を行います。実験室分光光度計を使用して、DNAの1マイクロリットルをロードし、定量のために216 nmで吸光度を測定する。
2%アガロースゲルに1マイクロリットルのDNAをロードし、80~100ボルトの電圧でゲル電気泳動を実行して定性評価を行います。DNA評価結果に基づいて、マルチプレックス短タンデム繰り返しPCR増幅に使用するDNAの量を選択します。最低1000ナノグラムのDNAを使用することを目指してください。
テキストプロトコルに記載されているように、PCR増幅、毛細管電気泳動、およびデータ分析に進みます。理想的なFFPEブロックを選択するには、光顕微鏡上でH&Eスライドを使用して、絨毛膜絨毛から構成される組織の約50〜70%を有するFFPEブロックを選択する。絨毛性絨毛の理想的な量を有しないブロックについては、断面化が行われるように絨毛絨毛絨毛のために濃縮する。
これを行うには、切りたてのセクションのどちら側に、対応するH&Eスライドに従って、より多くの絨毛絨毛が含まれているかを特定します。その後、絨毛性絨毛のために濃縮するために廃棄する必要がある残りの半分を切断するためにブレードを使用してください。最良のFFPEブロックの断面化を行うために、マイクロトームを使用して厚さ50ミクロンの4つのセクションを切断します。
理想的なFFPEブロックが利用できない場合には、それにもかかわらず、母親の組織に対する絨毛絨毛絨毛の比率を維持することを目指す。例えば、ブロックの30%だけが絨毛性絨毛で構成されているが、残りは母親の組織を持っている場合、母体組織を含むセクションの少なくとも半分を取り除き、より多くのセクションを使用して補償する。15 mLチューブにセクションを配置します。
脱パラフィンと水分補給のために、ヒュームフードで各試薬を添加し、テキストプロトコルで表されたように適切な期間を待ちます。次いで、パスツールピペットを用いて真空吸引により試薬を除去する。次に、15 mLチューブに摂氏4度のクエン酸溶液を加えます。
摂氏80度の水浴に2時間入れた後、溶液を室温まで冷まします。真空吸引によりクエン酸溶液を除去します。1x PBS、渦の6ミリリットルを追加し、組織が底に落ち着くように1〜2分待ちます。
必要に応じて、サンプルを1000 RPMで30秒間遠心します。真空吸引により1X PBSを取り外します。今、予熱ペプシン溶液の1 mLを追加し、30分間摂氏37度のドライバスに入れます。
10分ごとに渦。このインキュベーションの最後の10分間にヨウ化リボヌクレアーゼA溶液のプロピジウムを調製する。さらに6mLの1x PBS、渦を加え、組織が底に落ち着くように1〜2分待ちます。
再度、真空吸引によって1x PBSを取り除きます。550マイクロリットルのヨウ化プロピジウム・リボヌクレアーゼA溶液を加え、37°Cの乾燥浴に30分間サンプルを入れます。フォースを使用して、フローサイトメーターで使用するためにポリスチレンラウンドボトムチューブの上部に48ミクロンろ過メッシュの5 cm×5 cmの部分を配置します。
液体をメッシュを通してチューブに入れ、溶液をフィルター処理します。これで、サンプルはフローサイトメーターで実行できます。彼らは実行する準備が整うまで、箔で包んだままにしてください。
最後に、テキストプロトコルに記載されているように、フローサイトメトリーとデータ分析を行います。部分ヒダチフォームモグラのマイクロサテライト遺伝子型は、患者および彼女のパートナーのDNAと共に、患者のほくろが三重不定皮症であることを明らかにする。最初の第1マーカーは、受胎の産物における2つのピークを示す。
最初のピークは母親だけにこの大きさのピークがあるので、母親に由来します。同じ推論に続いて、2番目のピークは、彼が同じアリエールを共有しているので、父親に由来します。2番目のピークが最初のピークよりもはるかに高い方法に注意してください, おそらくそのピークに同じ父性アレーレの2つの用量があることを示します.
母親の汚染は、第2の母親のアレーレの位置に非常に小さなピークを表示するため、この受胎の製品では非常に最小限です。第2マーカーは、受胎の産物の3つのピークを示す。これらのピークのうちの2つは父親に由来し、1つは母親に由来します。
3番目と4番目のマーカーは最初のマーカーに似ており、父親と母親から来た2つの対立分も示しています。4つのマーカーはすべて一貫して3つの対立アレスを示し、2つは父親から、もう1つは母親から来ているので、この受胎の産物は三分不定皮であると結論付けることができ、部分的なほくろの診断を確認する。ジェノタイピングの結果を解釈するには、洗浄工程で取られたメモに基づいて汚染のレベルを認識することが重要です。
場合によっては、これら2つの方法に従って結論を出すことができません。このような場合、私たちは、真の遺伝子型を明らかにするために、FISHなどの他の方法を使用します。マイクロサテライトのジェノタイピングは、正確なモル診断を可能にし、ヒダチ型の様々な特徴に関連する遺伝子型をよりよく理解する道を開いた。
