この作品は、ウェスタン·オンタリオ、産科と婦人科の大学によってサポートされていました。とMinistryof研究とイノベーション、初期のリサーチャー賞からの助成金ER06-02-188。 MMDは、再生、早期開発と健康（REDIH）大学院奨学金への影響のCIHRのトレーニングプログラムによってサポートされていました。

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	<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).</li><li>Rodenhiser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+human+disease:+translating+basic+biology+into+clinical+applications.">Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications.</a> CMAJ. 174, 341-348 (2006).</li><li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).</li><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+analysis+on+individual+chromosomes:+improved+protocol+for+bisulphite+genomic+sequencing.">Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).</li><li>Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bisulfite+method+of+5-methylcytosine+mapping+that+minimizes+template+degradation.">A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation.</a> Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).</li><li>Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Methylation:+Bisulphite+Modification+and+Analysis.">DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis.</a> J. Vis. Exp. (56), e3170 (2011).</li><li>Olek, A., Oswald, J., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+and+improved+method+for+bisulphite+based+cytosine+methylation+analysis.">A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis.</a> Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).</li><li>Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+imprinting+in+the+placenta+following+preimplantation+development+in+culture.">Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture.</a> Development. 131, 3727-3735 (2004).</li><li>Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+effects+of+superovulation:+loss+of+maternal+and+paternal+imprinted+methylation+in+a+dose-dependent+manner.">Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).</li><li>Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+on+bisulfite+sequencing+method+for+methylation+status+of+imprinted+genes+in+single+human+oocytes.">A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes.</a> Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).</li><li>Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+imprinting+perturbations+do+not+originate+from+superovulation-induced+defects+in+DNA+methylation+acquisition.">Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition.</a> Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).</li><li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>Hajj, N. E. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+dilution+bisulfite+(pyro)sequencing+reveals+parent-specific+methylation+patterns+in+single+early+mouse+embryos+and+bovine+oocytes.">Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes.</a> Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

この単一の卵母細胞アッセイは重要であり、特別なケアを必要とする数多くの手順が含まれています。最初は卵母細胞の洗浄です。それは、できるだけ多くの卵丘細胞のように削除するヒアルロニダーゼ処理後に廃棄し新鮮な培地に各卵母細胞を複数回洗浄することが特に重要である。また、透明帯を除去するため、酸性タイロード液に卵を転送するときは、周囲の媒体が卵丘細胞の明確で?...

特定の試薬 ​​や機器のテーブルです。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td colspan="4"> 卵母細胞コレクション </td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>シグマ</td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td>酸性タイロード</td><td>シグマ</td><td> T1788 </td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK </td><td>シグマ</td><td> P5568 </td><td></td></tr><tr><td> 10％IGEPAL </td><td> Bioshop </td><td> NON999.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 溶菌液 </td></tr><tr><td>トリス（pH7.5） </td><td> Bioshop </td><td> TRS001.5 </td><td></td></tr><tr><td> LiClを</td><td>シグマ</td><td> L9650 </td><td> ＆n個のBSPは、 </td></tr><tr><td> EDTA pH8.0で</td><td>シグマ</td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> LIDS </td><td> Bioshop </td><td> LDS701.10 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td>インビトロジェン</td><td> P2325 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> SDS溶解バッファー </td></tr><tr><td> TE pH7.5の</td><td> Bioshop（トリス） シグマ（EDTA） </td><td> TRS001.5 E5134 </td><td></td></tr><tr><td> 10％SDS </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Bisulfite変換 </td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S8045 </td><td></td></tr><tr><td>亜硫酸ナトリウム（亜硫酸水素ナトリウム） </td><td>シグマ</td><td> 243973 </td><td>; </td></tr><tr><td>ハイドロキノン</td><td>シグマ</td><td> H9003 </td><td></td></tr><tr><td>低融点（LMP）アガロース</td><td>シグマ</td><td> A9414 </td><td></td></tr><tr><td>鉱油</td><td>シグマ</td><td> M8410 </td><td></td></tr><tr><td> M2中</td><td>シグマ</td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> GIBCO蒸留水</td><td>インビトロジェン</td><td> 15230-196 </td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ滅菌蒸留（DD）水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> PCR </td></tr><tr><td> IllustraホットスタートミックスRTG </td><td> GEヘルスケア</td><td> 28-9006-54 </td><td></td></tr><tr><td> 240 ng / mlの酵母tRNA </td><td>インビトロジェン</td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> 5倍グリーンGoTaq反応バッファー</td><td>プロメガ</td><td> M7911 </td><td></td></tr><tr><td>内側と外側のネストされたプライマー</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> ライゲーション </td></tr><tr><td>プロメガのpGEM-T Easyベクター</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A1360 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> TAクローニング </td></tr><tr><td>有能な大腸菌細胞</td><td> Zymoリサーチ（株） </td><td> T3009 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 機器 </td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 70°Cと90°Cヒートブロック</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37°Cと50°C Waterbaths（42°Cの変換用） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロッカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCRマシン</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single oocyte bisulfite mutagenesis

エピジェネティクスは、すべてがこのように遺伝子のアクセシビリティを変更し、遺伝子の転写1を調整するための主要なメカニズムであることをクロマチンに遺伝性で可逆的改変を包含する。 DNAメチル化は、抑圧的なマークとして主に作用するエピジェネティックな修飾である。 CpGジヌクレオチドのシトシン上のメチル基の共有結合的付加により、それは、クロマチンを凝縮と遺伝子2をサイレンシングに関与するプロセスを開始するために追加の抑圧的なタンパク質やヒストン修飾を募集することができます。それは発達のプログラミング、細胞分化、レトロエレメントの弾圧、X染色体不活性化とゲノムインプリンティングに重要な役割を果たしているDNAのメチル化は正常な発達に不可欠である。 DNAメチル化解析のための最も強力な方法の一つは、亜硫酸水素塩の突然変異誘発である。亜硫酸水素ナトリウムは、ウラシルにシトシンをdeaminates DNAの変異原である。 PCR増幅とseque以下<html> ncingは、これらの変換イベントはチミンとして検出されます。メチル化シトシンは脱アミノ化から保護するため、個々のヌクレオチドレベル3でDNAメチル化の同定を可能にする、シトシンのままにされています。亜硫酸塩の突然変異誘発アッセイの開発は、当初より高感度と7再現性のあるものに向かって4-6を報告されたものから発展してきた。一つの重要な進歩は、それによって過酷な重亜硫酸塩処理8からDNAを保護し、アガロースビーズにDNAの少量を埋め込 ​​むされました。卵母細胞および胚盤胞段階の胚9のプール上で実行するために、この対応のメチル化解析。これまでで最も洗練された亜硫酸塩の突然変異誘発のプロトコルは、個々の胚盤胞段階の胚は10です。胚盤胞は、平均64個のセル（ゲノムDNAの120から720 pgを含む）を持っているのでしかし、この方法は、個々の卵母細胞または切断ステージ胚におけるメチル化研究のための効果的ではありません。 テント&quot;&gt;卵母細胞11を含む分DNA量の埋め込 ​​みをアガロースから手がかりをとると、ここでは卵母細胞を直接検索し、卵母細胞から透明帯を除去した後、直ちにアガロース溶解ソリューションビーズに埋め込 ​​まれているさせる方法を提示します。これは私たちに可能単一の卵重亜硫酸突然変異誘発の2つの主要な課題を回避する：多数のプロトコルステップの間に低下し、その後の損失からのDNAの微量を保護する重要なことは、データが単一の卵母細胞から得られたとして、プール内のPCRバイアスの問題が排除されるさらに。複数のメチル化パターンを持つ任意のサンプルはこのプロトコルは、単一細胞レベルでのDNAメチル化の成功と再現性の解析のための改良方法を提供する。分析12から除外されることがあり、理想的に適していますので、不注意な卵丘細胞の混入は、この方法で検出可能である個々の卵母細胞と同様に開裂段階の胚のために。

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Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

亜硫酸塩の突然変異誘発は、DNAメチル化を解析するためのゴールドスタンダードです。私たちの変更されたプロトコルは、単一細胞レベルでのDNAメチル化解析を可能にし、特に個々の卵のために設計されました。また、開裂段階の胚に使用することができます。

単一の卵重亜硫酸塩の突然変異誘発

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

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13.9K ビュー.  Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario. 亜硫酸塩の突然変異誘発は、DNAメチル化を解析するためのゴールドスタンダードです。私たちの変更されたプロトコルは、単一細胞レベルでのDNAメチル化解析を可能にし、特に個々の卵のために設計されました。また、開裂段階の胚に使用することができます。