このプロトコルは、ミトコンドリア病を研究するために脳オルガノイドを使用することを目的としています。ミトコンドリアの特性評価において再現性のある脳オルガノイドを生成するために開発されました。この方法は、高価なバイオリアクターと時間のかかる埋め込み手順を必要としません。
したがって、実装とアップスケールが容易です。このプロトコルは、再現性脳オルガノイドを生成し、そのミトコンドリアの特性をテストすることを可能にします.これは、治療不可能なミトコンドリア病の介入標的の同定につながる可能性があります。
まず、6ウェルプレートにコーティングされたiPSC培地でフィーダーフリー条件でヒトiPSCを培養し、加湿組織培養インキュベーターで摂氏37度と5%の二酸化炭素を保ちます。iPSCを80%合流で通過し、酵素を含まない剥離媒体を使用して、1~4~12の比率で対応しています。細胞生存率を高めるために、各分割後に10個のマイクロモルロ関連プロテインキナーゼまたはROCK阻害剤を加える。
80%iPSCをゼロ日に解約します。皮質分化培地1またはCDM1を準備し、細胞に加える前に室温で事前に温めます。IPSCを含む井戸をPBSで洗浄し、死んだ細胞や破片を除去します。
各ウェルに500マイクロリットルの予熱化試薬Aを加え、摂氏37度で5分間インキュベートします。顕微鏡で確認して、細胞の剥離を確認します。iPSC培地を1ミリリットル加え、試薬Aを希釈して活性を中和する。
1,000マイクロリットルピペットを使用して、上下に配管して細胞を解体し、細胞懸濁液を15ミリリットルの遠心分離管に移します。iPSCを室温で5分間5分間Gの125倍に静かに遠心し、上清を慎重に吸引して細胞ペレットを乱さないようにします。1ミリリットルのCDM1でペレットを再懸濁して、単一の細胞懸濁液を得て、細胞数を数える。
20マイクロモルロック阻害剤、3マイクロモルWNTカテニン阻害剤またはIWR-1、および5マイクロモルSB-431542を補ったCDM1の100マイクロリットルあたり9,000iPSCで播種培地を調製します。96ウェルV底板にウェルあたり100マイクロリットルの播種培地を加えます。プレートを加湿した組織培養インキュベーターで摂氏37度、二酸化炭素5%に保ちます。
神経球を生成するには、初日に、定義された滑らかな境界を持つ丸い細胞集合体が形成されていることを観察する。集計の周囲の死んだセルに注意してください。37°Cと5%の二酸化炭素で培養を継続します。
3日目には、側面を3回タップしてプレートを攪拌して死んだ細胞を取り外し、20マイクロモルROCK阻害剤、3つのマイクロモルIWR-1、および5つのマイクロモルSB-431542を補ったCDM1の100マイクロリットルを各ウェルに加えます。プレートをインキュベーターに摂氏37度、炭酸ガス5%に保ちます。6日目には、各井戸から80マイクロリットルの上清培地を慎重に取り除きます。
井戸の底部に触れないようにしてください。3つのマイクロモルIWR-1と5つのマイクロモルSB-431542を補ったCDM1の100マイクロリットルを各井戸に加え、プレートをインキュベートします。18 日目まで 3 日ごとに前の手順を繰り返します。
18日目に、神経球を移管し、CDM2を調製し、100ミリメートル超低付着細胞培養プレートに10ミリリットルを加える。先端を切り取った200マイクロリットルピペットを使用して、96ウェルプレートから100ミリメートル超低接続細胞培養プレートに丸い神経球を移動させます。神経球を含むプレートから培地の5ミリリットルを除去し、新鮮なCDM2の5ミリリットルを追加します。
37°Cと5%の二酸化炭素で加湿された組織培養インキュベーターの中で毎分70回転で軌道シェーカーの上にプレートを置きます。3日おきに上清培地を慎重に吸引し、新鮮なCDM2に交換してください。少量の培地を残して、神経球が乾燥するのを防ぎます。
35日目にCDM3を準備します。プレートから培地を吸引し、10ミリリットルの冷たいCDM3を加えます。培地を交換した後、プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%の加湿組織培養器内で毎分70回転で軌道シェーカーに戻します。
培地の色で示される成長率に応じて、3~5日ごとに培地を変更します。70日目に、CDM4を準備します。オルガノイドの所望の年齢に達するまでCDM4培地を使用してください。
この期間中、加湿組織培養インキュベーター内の1分間に70回転に設定された軌道シェーカーのプレートを摂氏37度と二酸化炭素5%に保ちます。成長率に応じて、3~5日ごとに培地を変更します。4%PFA溶液を準備し、安全フードの下に置きます。
脳オルガノイドを収集し、PFAで満たされた6ウェルプレートに鈍い先端3ミリリットルプラスチックパスツールピペットでそれらを穏やかに転送します。PFA溶液中のオルガノイドを室温で1時間保管してください。慎重に3ミリリットルプラスチックパスツールピペットでPFAを取り出し、PBSを使用して固定オルガノイドを3回洗います。
固定オルガノイドは、さらに使用されるまでPBSで摂氏4度で保存します。このプロトコルを用いて生成されるオルガノイドには、軸索および樹状突起に特異的なタンパク質マーカーを用いて可視化できる成熟したニューロンが含まれています。成熟したオルガノイドには、神経細胞だけでなく、グリア細胞も含まれています。
スライスされた脳オルガノイド分析を用いて、SMI 312陽性軸索およびMAP2陽性樹状突起またはS100ベータグリア細胞を監視することができる。さらに、共焦点画像は、β-3の尿管陽性ニューロンに関するSOX2陽性神経前駆体の詳細な分布および組織を調査するのに役立つ。脳オルガノイドは、外膜またはTOM20のトランスロケースのようなミトコンドリア特異的マーカーについて染色した。
脳オルガノイドの生体エネルギープロファイリングは、酸素消費率、OCR、および細胞外酸性化率、またはECARを用いた解糖代謝を用いてミトコンドリア代謝の両方を測定することによって行われた。オリゴマイシンはOCRプロファイルの低下を引き起こし、したがってATP生産に必要なOCRを特定する。オリゴマイシン処理の際に、ECARの代償的な増加が起こる可能性があり、細胞が代謝ストレスを防ぐために解糖をアップレジトリー状態にすることができることを示唆している。
96ウェルプレートから培養プレートに神経球を移管する場合、または固定手順中に、オルガノイドを優しく扱い、損傷を避けるために重要です。脳オルガノイドの生成に続いて、マルチ電極アレイまたはカルシウムイメージングは、オルガノイドの機能性をテストするための理想的な方法であろう。
